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        經濟實用型白脂素原核表達與純化方法構建
        發布時間:2020-04-07

          摘    要: 目的 構建白脂素的原核表達質粒, 表達及純化重組白脂素蛋白, 并初步探索其功能, 為進一步研究白脂素作用機制及其生理病理作用提供依據。方法 利用基因工程技術構建表達白脂素BL21菌株, 經異丙基硫代半乳糖苷誘導, 梯度尿素復性, 親和層析純化及去內毒素處理得到可用于細胞和動物實驗的重組白脂素。采用血糖儀檢測重組白脂素腹腔注射后C57小鼠血糖變化情況。Alamar Blue檢測重組白脂素作用24 h對MIHA細胞活性的影響;重組白脂素刺激MIHA細胞24 h, 用蒽酮法檢測糖原含量。結果 在37℃, A600 nm=0.8, IPTG終濃度為1 mmol/L誘導4 h目的蛋白表達效果較好。通過純化和去內毒素處理, 重組白脂素純度大于95%, 內毒素含量小于1 EU/mg, 可以用于動物與細胞實驗。腹腔注射重組白脂素60 min后C57小鼠血糖升高至峰值 (重組白脂素組vs對照組P=0.021) , 120 min恢復到正常水平 (重組白脂素組vs對照組P=0.03) 。重組白脂素刺激MIHA細胞24 h, 對細胞活性沒有影響;檢測糖原發現, 不同濃度白脂素組糖原與對照組比較差異有統計學意義 (P1=0.013, P2=0.036, P3=0.011) 。結論 通過原核表達系統成功表達及純化了白脂素蛋白, 該方法純化后的白脂素具有降低MIHA細胞糖原含量及升高小鼠血糖的作用, 這為白脂素功能的進一步研究提供了理論依據。

          關鍵詞: 原核表達與純化; 包涵體; 白脂素; 糖原分解; 血糖;

          Abstract: Objective The obtain purified recombinant asprosin and test its functions. Methods The recombinant plasmid of pET-22 b-asprosin was constructed and transformed into competent E.coli BL (DE3) strain. After IPTG-induced expression, asprosin inclusion body was renatured by gradient urea and purified by Ni-NTA affinity chromatography column followed by removal of endotoxin to obtain recombinant asprosin for use in cells and animals experiments. C57 mice were injected intraperitoneally with the recombinant asprosin and blood glucose was detected using a blood glucose meter. Alamar Blue assay was used to evaluate of the effect of the recombinant asprosin on the viability of MIHA cells, and cellular glycogen content was detected using the anthrone method. Results At the absorbance at 600 nm of 0.8, induction of the recombinant host bacteria with 1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 h optimally induced the expression of asprosin inclusion body. After purification and endotoxin removal, the purity of the recombinant asprosin exceeded 95% with the content of endotoxin below1 EU/mg. In C57 mice, intraperitoneal injection with recombinant asprosin significantly increased blood glucose level, which reached the peak level at 60 min following the injection (P=0.021) and recovered the normal level at 120 min (P=0.03) .Treatment with the recombinant asprosin for 24 h did not cause obvious adverse effect on the viability of MIHA cells but significantly lowered glycogen content in the cells (P<0.05) . Conclusion We successfully obtained recombinant asprosin using a prokaryotic expression system. The recombinant asprosin can decrease glycogen content in MIHA cells and increase blood glucose level in mice.

          Keyword: prokaryotic expression system; inclusion body; asprosin; glycogen; blood glucose;

          白脂素是2016年在Cell首次報道的一種葡萄糖調控的蛋白質類激素, 最初是在研究新生兒型早衰綜合征發病機制中發現[1]。它是由原纖維蛋白1 (FBN1) 基因編碼的原纖維蛋白1的C末端截斷突變而來的裂解產物[1,2]。該激素可升高血糖水平, 增加胰島素抵抗, 因此被認為是治療肥胖和糖尿病潛在的分子靶標[1], 一經發現即引起了極大的關注[3,4]。進一步的研究發現白脂素在多種代謝性相關疾病, 如2型糖尿病、多囊卵巢綜合征、成年肥胖、糖耐量異常等患者血清和血漿中白脂素水平均高于正常人[5,6,7,8,9,10]。利用腺病毒在小鼠肝臟細胞中高表達白脂素, 其肝臟糖合成效率大幅增加[1];肥胖小鼠腹腔注射白脂素抗體后, 可以顯著降低食欲和體質量, 同時血中胰島素水平也下降[11]。提示白脂素在各類代謝性相關疾病中有著重要作用, 可能會成為這些疾病的潛在治療靶點。

          目前開展的白脂素研究多為對臨床標本的檢測, 關于細胞和動物實驗較少, 為了進一步探索白脂素作用的分子機制和對糖脂代謝的影響, 需要獲得大量純化且具有功能的重組白脂素蛋白以用于開展細胞和動物實驗研究。現有研究中白脂素表達純化方法多為利用原核系統表達的可溶性蛋白[12], 此方法獲得的重組蛋白產量較低, 無法滿足后續實驗研究的需要。而采用原核系統表達的包涵體經適當的溶解和復性后可獲得大量的有功能的蛋白產物。為了獲得大量有功能的重組白脂素蛋白, 本研究探索了白脂素包涵體表達與純化的方法, 首次采用包涵體洗滌溶解, 梯度尿素透析復性與親和層析純化相結合的方法純化了白脂素重組蛋白;純化后的蛋白質通過考馬斯亮藍染色和蛋白免疫印跡進行表達驗證, 并在小鼠體內注射進行功能驗證。采用驗證后的重組蛋白初步探索了白脂素對人MIHA肝細胞活性及糖原含量的影響。本研究建立一種經濟有效的白脂素原核表達與純化方法, 為白脂素分子作用機制和臨床應用的研究奠定基礎。
         

        經濟實用型白脂素原核表達與純化方法構建
         

          1 、材料和方法

          1.1 、材料

          1.1.1 、菌株、質粒與細胞、動物

          感受態菌株E.coli DH5α與E.coli BL21 (DE3) 購于天根生化科技 (北京) 有限公司, 菌株DH5α用于保存質粒, BL21 (DE3) 用于表達蛋白質;His-asprosin pET-22b質粒合成于武漢金凱瑞公司。原核表達的宿主菌培養于LB培養基中。MIHA肝細胞由廣西中醫藥大學冷靜教授饋贈, 在37℃, 5%二氧化碳環境中, 培養于含10%FBS, 0.1%環丙沙星的1640培養基中。雌性C57BL/6小鼠購于廣西醫科大學實驗動物中心 (SCXK桂2014—0002) , 本實驗獲得廣西醫科大學實驗動物中心動物實驗倫理審查許可, 涉及動物的實驗操作符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

          1.1.2、 主要試劑與儀器

          His標簽蛋白純化試劑盒、溶菌酶、蛋白酶抑制劑 (碧云天) ;去內毒素柱 (賽默飛) ;透析袋 (Viskase) ;生化培養箱 (博訊) ;高速離心機 (Eppendorf) ;超聲裂解儀 (天根生化科技) ;水平搖床 (賽默飛) ;其他試劑為國產分析純。

          1.2 、方法

          1.2.1、 白脂素表達載體的構建

          白脂素基因由FBN1的65號外顯子和66號外顯子共同編碼而來。根據在美國國家生物技術信息中心(NCBI)查找的人FBN1 mRNA基因序列,參考文獻[1,2,11]后我們推算編碼白脂素基因片段是NM_000138.4 (8592-9011),該序列為FBN1mRNA的CDS區。針對該序列做以下的優化:在N端連接His序列,同時在兩端增加NcoⅠ和BlpⅠ酶切位點以及兩個補位基因。將人工合成的優化后白脂素基因和pET-22b質粒用限制性內切酶Ncol和Blpl進行雙酶切,再用T4DNA連接酶進行連接,即可得到包含人白脂素的pET-22b載體質粒,將其命名為pET-22b-asprosin。

          1.2.2、轉化感受態細胞

          采用熱激法轉化感受態細胞DH5α與BL21。從-70℃取出100μL感受態細胞于冰水中解凍,加入10 ng pET-22b-asprosin質粒冰浴中靜置30 min;42℃水浴90 s后冰浴3 min;加入900μL不含抗生素的LB培養基,37℃,150 r/min搖床振蕩培養45 min;取20μL菌液在含有100μg/mL氨芐青霉素的固體培養基上涂布,37℃倒置培養12~16 h后挑取單克隆菌落,加入15 mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中,37℃,150 r/min搖床振蕩培養12~16 h后分裝并保存于-80℃,并取1 mL送Life公司測序。

          1.2.3 、表達條件優化

          取20μL測序無誤的細菌接種在含100μg/mL氨芐青霉素和1%葡萄糖的LB培養基中, 37℃, 150 r/min搖床振蕩培養12~16 h;4℃、4500 g離心5 min后, 用含1 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 的LB培養基重懸至A600 nm約為0.6~0.8;37℃, 110 r/min搖床振蕩誘導4 h;在誘導0、1、2、4 h分別取20μL菌液進行SDS-PAGE電泳, 并用考馬斯亮藍染色。將誘導4 h后的菌液在4℃、4500 g條件下離心5 min, 收集沉淀。

          1.2.4 、包涵體變性與復性、純化

          取37℃誘導4 h的菌液4℃、5000 g離心6 min收集沉淀, 按1 g菌體加入2~5 mL非變性裂解液, 混勻后按1∶100比例加入溶菌酶, 4℃放置30 min (每5 min振搖1次) ;-80℃凍融2次, 然后在冰上超聲裂解5 min, 超聲裂解后4℃、12 000 g離心20 min收集沉淀, 沉淀即為包涵體。

          包涵體使用2%脫氧膽酸鈉洗滌30 min, 超純水洗滌2次, 然后用包涵體溶解液 (8 mol/L尿素、50 mmol/L Tris·HCl, 1 mmol/L EDTA, 調pH至8.0) 溶解沉淀2 h;按照表1進行透析復性, 并按照復性前后包涵體重量判斷復性效率。

          收集透析后的液體用His標簽蛋白純化試劑盒按照說明書進行親和層析純化。簡述如下:用非變性裂解液平衡鎳柱5次后, 4℃上樣, 并收集穿流液, 然后用1 mL洗滌液洗柱5次并收集洗滌液, 最后用0.5 mL洗脫液洗脫目的蛋白6~10次并收集洗脫液。收集獲得的洗脫液即為純化的白脂素樣品, 對純化后的樣品進行SDS-PAGE電泳初步判斷其純度。

          1.2.5 、表達蛋白鑒定與去除內毒素

          對親和層析后收集的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳, 用考馬斯亮藍染色后計算蛋白純度;使用白脂素抗體對純化的目的蛋白通過蛋白免疫印跡法進行鑒定;用PBS透析收集經過親和層析的重組白脂素, 再用去內毒素試劑盒去除內毒素, 最后檢測重組白脂素內毒素范圍, 過濾后分裝保存。

          表1 包涵體梯度尿素復性條件
        表1 包涵體梯度尿素復性條件

          1.2.6、 重組白脂素對C57小鼠血糖的影響

          雌性8周齡C57BL/6小鼠8只, 適應性喂養后隨機分為2組, 每組4只小鼠。實驗組按30μg/只腹腔注射重組白脂素, 對照組注射等量生理鹽水。過夜禁食后, 從尾部取血, 用血糖測量儀檢測注射前血糖;再分別從尾部取血檢測腹腔注射重組白脂素后30、60、120 min的血糖。

          1.2.7 、Alamar Blue法檢測重組白脂素對MIHA細胞活性的影響

          從細胞培養瓶中收集對數生長期的MIHA細胞接種于96孔板中, 每孔細胞數1×105個;設置4組, 每組5個復孔, 1組為對照組, 其他3組分別加入終濃度1、10、100 nmol/L的重組白脂素。96孔板在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養過夜使細胞完全貼壁;更換為無糖培養基后處理組分別加入重組白脂素至終濃度為1、10、100 nmol/L, 對照組不加白脂素, 繼續培養24 h后加入Alamar Blue孵育0.5 h用酶標儀檢測各孔熒光值, 并計算平均值;與對照組比較判斷白脂素作用24 h對MIHA細胞活性的影響。

          1.2.8 、純化的白脂素對MIHA肝細胞糖原的作用

          根據細胞生長和增殖情況, 將對數生長期的細胞按每孔7.5×105細胞密度接種到六孔板中, 37℃、5%CO2細胞培養箱中培養過夜至完全貼壁。分別設置對照組和實驗組, 更換為無糖培養基后, 實驗組分別加入1、10、100 nmol/L白脂素, 對照組不加白脂素, 繼續培養24 h后用糖原提取液收集細胞, 蒽酮法檢測細胞糖原含量。

          1.2.9 、統計分析

          實驗數據采用軟件GraphPad Prism 6和Excel進行整理分析;用SPSS 23.0軟件進行統計分析, 兩組之間比較用t檢驗, 多組之間比較用單因素方差分析, P<0.05表明差異有統計學意義。

          2、 結果

          2.1、 p ET-22b-asprosin質粒測序、His-Asprosin表達、包涵體復性及純化條件

          質粒測序結果表明插入序列大小及閱讀框架均正確。所獲得的基因經SnapGene軟件分析與設計的pET-22b-asprosin序列完全一致。原核表達載體pET-22b-asprosin轉化表達宿主菌E.coli BL21 (DE3) , 分別在16、25和37℃條件下, 用0.1、0.5、1 mmol/L IPTG誘導4、12、24 h, 收集菌體超聲破碎后發現各組重組白脂素均呈包涵體表達, 對各反應條件比較后, 選用IPTG終濃度1 mmol/L, 37℃誘導4 h作為后續誘導表達條件。復性前后包涵體重量分別為23.3 mg和1.3 mg, 據此判斷, 復性效率大于90%。進行鎳柱親和層析純化時, 用含不同濃度的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白, 當咪唑濃度為150 mmol/L時, 目的蛋白的洗脫效果最好, 洗脫后可以獲得較高純度的目的蛋白。

          2.2、 重組蛋白的驗證

          將去除內毒素后的蛋白質過濾除菌后分裝, 蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳, 用考馬斯亮藍染色, 結果如圖1A, 計算蛋白質純度大于95%。采用白脂素抗體對純化的蛋白進行免疫印跡分析, 結果條帶位置與考馬斯亮藍染色后的一致 (圖1B) , 說明純化后的蛋白質為白脂素蛋白。經過純化和去內毒素等步驟最后獲得的蛋白質純度大于95%, 內毒素含量小于1 EU/mg, 蛋白濃度為0.34 mg/mL, 純化產量約0.5 mg/g細菌, 純化的蛋白可以用于后續的細胞和動物實驗。

          2.3、 腹腔注射重組白脂素對小鼠血糖的影響

          過夜禁食后, 兩組小鼠從尾部取血用血糖儀檢測注射前血糖;實驗組每只小鼠按30μg腹腔注射重組白脂素, 對照組注射等量生理鹽水, 分別檢測注射后30、60、120 min血糖。結果顯示與對照組相比, 腹腔注射重組白脂素的小鼠血糖在注射后60 min升高達到峰值, 在注射后120 min基本恢復到正常水平 (圖2) , 且在注射后60 min和120 min, 注射重組白脂素組小鼠血糖高于對照組, 差異有統計學意義 (P1=0.021, P2=0.03) 。

          2.4 、白脂素對MIHA細胞活性的影響

          用Alamar Blue法檢測白脂素作用24 h后對MIHA細胞活性的影響, 結果顯示與對照組相比, 1、10、100 nmol/L白脂素作用24 h對MIHA細胞活性均沒有影響 (圖3A) 。

          圖1 重組白脂素的鑒定
        圖1 重組白脂素的鑒定

          Fig.1 Identification of the recombinant asprosin.A:Identification of the relative molecular mass and purity of the recombinant asprosin by SDS-PAGE and Coomassie blue;B:Identification of the recombinant asprosin by Western blotting with anti-asprosin antibody.

          圖2 外源給予重組白脂素對C57小鼠血糖的影響
        圖2 外源給予重組白脂素對C57小鼠血糖的影響

          Fig.2 Effect of recombinant asprosin on blood glucose in C57mice (n=4, *P<0.05) vs control.

          2.5、 重組白脂素對MIHA細胞糖原代謝的作用

          MIHA細胞更換為無糖培養基后, 處理組分別加入1、10、100 nmol/L重組白脂素, 對照組不加白脂素, 在37℃、5%CO2環境下繼續培養24 h后, 用糖原提取液收集細胞, 蒽酮法檢測糖原含量。結果顯示與對照組相比, 加入白脂素刺激的組別糖原含量更低 (圖3B) , 不同濃度白脂素組與對照組比較差異有統計學意義 (P1=0.013, P2=0.036, P3=0.011) , 不同濃度白脂素組間差異無統計學意義 (P>0.05) 。

          3、 討論

          研究發現, 脂肪組織除了有儲存脂肪的作用, 其分泌的多種細胞因子和激素如脂聯素、鳶尾素、瘦素等在人體的能量代謝、葡萄糖調控、食欲調節等生理過程中有重要的作用[13,14,15]。白脂素是白色脂肪組織分泌的蛋白質類激素之一, 具有促進肝葡萄糖產生和刺激食欲的作用[1,11,16];可以通過免疫隔離的方式阻斷白脂素對血糖和胰島素的作用[1]。目前研究表明白脂素在2型糖尿病、多囊卵巢綜合征、葡萄糖調節異常、肥胖、2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝及冠心病患者血漿和血清中含量較正常人群高, 而在肥胖兒童血漿中白脂素水平是降低的[5,7,8,9,10,17,18]。但關于白脂素發揮生理功能時具體作用機制尚不清楚, 本實驗通過建立白脂素原核表達系統, 生產具有功能的重組白脂素蛋白, 為白脂素作用機制研究及其臨床應用提供依據。

          本研究首次采用原核表達系統表達白脂素包涵體蛋白, 并通過洗滌溶解和梯度尿素透析的方法使包涵體復性;同時利用SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色、蛋白免疫印跡法驗證了所表達的蛋白, 且優化了表達和純化的條件, 獲得純度較高的重組蛋白。國內關于白脂素原核表達的研究表明, 上清中可溶重組白脂素蛋白含量較低, 本研究中采用的大腸桿菌原核表達系統表達包涵體的方法具有產量高、蛋白穩定、容易純化的優點, 在包涵體洗滌溶解和復性后可以得到大量的目的蛋白, 能滿足長期和大劑量實驗研究[12,20,21,22]。目前認為包涵體形成主要是由于外源蛋白在細胞內的高表達使得蛋白質合成速度過快, 不能形成正確的折疊, 以及缺少翻譯后修飾、培養溫度、pH等因素存在[20,23,24]。通常需要經過洗滌溶解、復性的過程使無活性的重組蛋白正確折疊恢復活性[25,26,27]。本研究收獲包涵體后, 用脫氧膽酸鈉溶液洗滌, 經包涵體溶解液溶解, 梯度尿素透析和非變性裂解液透析的方法使表達的包涵體成功復性, 利用所表達的蛋白上的His標簽結合到鎳柱上而達到純化的目的, 最后獲得純度大于95%的目的蛋白。采用白脂素抗體對純化的蛋白質進行蛋白免疫印跡后, 條帶位置與SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍染色后條帶的位置相同, 說明純化得到的蛋白為白脂素。重組的白脂素蛋白純度大于95%、內毒素含量低于1 EU/mg, 可以用于進行下一步的體外細胞和在體動物實驗[28], 為進一步研究白脂素的生物學特性、功能等奠定基礎。

          圖3 重組白脂素對MIHA細胞活性和糖原的影響
        圖3 重組白脂素對MIHA細胞活性和糖原的影響

          Fig.3 Effect of recombinant asprosin on viability and glycogen content in MIHA cells.A:Detection of MIHA cell viability by Alamar blue staining;B:Detection of glycogen content using anthrone sulfate.*P<0.05 vs control.

          為了驗證重組白脂素的功能, 過夜禁食的C57小鼠腹腔注射重組白脂素蛋白, 在注射后60 min小鼠血糖升高至峰值, 120 min恢復到正常水平, 這與Romere等[1]的研究中重組白脂素對小鼠血糖影響趨勢一致, 說明本研究所表達與純化的重組白脂素蛋白具有功能。利用有功能的重組白脂素刺激人MIHA肝細胞, 初步探索白脂素的功能。首先采用Alamar Blue法[29,30]檢測發現白脂素作用24 h對MIHA細胞活性沒有影響;然后在無糖培養基情況下用重組白脂素處理MIHA肝細胞, 與對照組比較發現加入白脂素組別的細胞糖原含量更低, 說明在饑餓情況下重組白脂素具有降低糖原的作用。肝臟是體內物質代謝至關重要的臟器, 在維持血糖穩定與代謝性疾病發生中有著舉足輕重的地位。Li等[31]的研究表明白脂素在肝臟中可以通過激活嗅覺受體OLFR734耦連的G蛋白-cAMP-PKA信號通路上調糖異生相關基因從而誘導肝葡萄糖產生, 但目前還沒有關于白脂素調節糖原釋放影響血糖具體作用機制的研究, 白脂素與糖原合成分解及糖異生之間的關系還有待深入的研究。

          本研究成功利用原核表達系統獲得了重組白脂素蛋白, 通過細胞和動物實驗發現白脂素在饑餓狀態下具有降低糖原、升高血糖的作用;國內研究表明白脂素具有抑制心功能損傷和抑制高糖環境下氧化應激介導的心肌細胞凋亡[12,32], 說明白脂素也與心血管疾病有重要關系。現有研究表明白脂素在多種代謝性相關疾病中有著重要的作用, 通過對它功能和相關分子作用機制的進一步研究, 白脂素有望成為治療多種疾病的有效靶點。

          參考文獻

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