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        1型糖尿病小鼠胰腺石蠟切片及其染色優化
        發布時間:2020-02-17

          摘    要: 目的 優化小鼠胰腺石蠟切片的制作程序并分析1型糖尿病小鼠胰腺免疫熒光染色結果。方法 多次小劑量鏈脲佐菌素誘導小鼠1型糖尿病,取胰腺,觀察采用不同試劑和處理時間的石蠟包埋程序對胰腺切片質量的影響,并探討胰腺石蠟切片免疫熒光染色的可能假陽性。結果 95%乙醇15min×2次、100%乙醇Ⅰ6min、100%乙醇Ⅱ7min、苯Ⅰ15min、苯Ⅱ18min、浸蠟90min時制作的小鼠胰腺石蠟切片質量最優。以小鼠抗高血糖素抗體(一抗)及FITC-山羊抗小鼠二抗免疫染色1型糖尿病小鼠胰腺時常常出現假陽性熒光。結論 脫水、透明、浸蠟等制作程序對小鼠胰腺石蠟切片質量影響較大;苯是優于氯仿與二甲苯的胰腺透明劑;1型糖尿病小鼠胰腺不適合以小鼠源抗體為一抗進行間接免疫熒光染色。

          關鍵詞: 石蠟切片; 胰腺; 免疫熒光染色; 非特異性染色;

          Abstract:  Objective To optimize the paraffin sections preparation procedure of mouse pancreas and analyze the results of immunofluorescence staining of pancreas in type 1 diabetic mice. Methods Repeated low doses of streptozotocin were used to induce mice model with type 1 diabetes mellitus. The pancreas were taken to explore the effects of different time and reagents for dehydration, transparency, paraffin immersion and paraffin embedding on the quality of pancreatic paraffin sections, and to explore the mechanism of possible immunofluorescent false positive staining in paraffin sections of pancreas. Results The best quality of mice pancreatic paraffin sections was obtained by adopting 95% ethanol 15 min×2 times, 100% ethanol I 6 min, 100% ethanol II 7 min, benzene I 15 min, benzene II 18 min and wax immersion 90 min. False-positive fluorescence staining was observed when the pancreas of type 1 diabetic mice were stained with mouse anti-Glucagon primary antibody and FITC-conjugated goat-anti-mouse secondary antibody. Conclusion Procedures such as dehydration, transparency and wax immersion have a great impact on the quality of paraffin sections of pancreas from mice. Benzene is superior to chloroform and xylene as pancreatic transparent agent. Mouse-derived antibody are not suitable as primary antibody for indirect immunofluorescent staining in pancreas of type 1 diabetic mice.

          Keyword:  Paraffin embedding; pancreas; immunofluorescence staining; non-specific staining;

          石蠟切片是組織學常規制片最廣泛應用的方法,經取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、攤片、貼片和烤片等一系列步驟而成[1,2]。因小鼠胰腺為非實體器官,外分泌部腺泡呈散在分布,故其石蠟切片常常碎裂不完整,組織褶皺,免疫組織化學染色時易脫片,嚴重影響后續研究;筆者在以1型糖尿病小鼠進行研究時發現,胰腺組織免疫熒光染色易致假陽性結果。對此,筆者通過系統實驗,探索1型糖尿病小鼠胰腺石蠟切片及其免疫熒光染色的優化策略,以制備優質的石蠟切片和規避免疫熒光假陽性染色,以期為后續胰腺相關研究提供技術保障。

          材料與方法

          1、實驗動物

          3月齡雄性C57BL/6J小鼠,購自濟南動物實驗中心。

          2、主要試劑和實驗儀器

          鼠抗高血糖素抗體(BOSTER)、兔抗高血糖素抗體(BOSTER)、FITC-山羊抗兔二抗(ZSGB-BIO)、FITC-山羊抗小鼠二抗(ZSGB-BIO)。石蠟包埋機、切片機(LEICA RM2235輪轉切片機)、攤烤片機(科迪KD-T電腦生物組織攤烤片機)。

          3、模型制作和取材固定

          鏈脲佐菌素40mg/(kg·d)連續5d腹腔注射,誘導小鼠1型糖尿病。頸椎脫臼處死,取胰腺,于濾紙上堆積成型,浸于4%多聚甲醛固定48h。
         

        1型糖尿病小鼠胰腺石蠟切片及其染色優化
         

          4、脫水、透明、浸蠟和包埋

          脫水:將固定的胰腺梯度酒精脫水,依次為70%乙醇30 min、80%乙醇20 min、95%乙醇5/10/15/20min×2次、100%乙醇4/6/8/10 min×2次,即95%、100%乙醇脫水分別嘗試4個不同的時間。

          透明:分別選用二甲苯、氯仿、苯3種透明試劑,各嘗試3個時間段。苯10/15/20 min×2次,或氯仿10/15/20 min×2次,或二甲苯透明時間為6/8/10min×2次。

          浸蠟:浸蠟時僅一次硬蠟,65℃,分別浸蠟60、90、120 min。

          包埋:石蠟包埋,凝固備用。

          5、切片與免疫熒光染色

          切片后進行如下常規處理:47℃攤片、貼片后61℃烤箱1 h、37℃烤箱1周。

          常規免疫熒光染色[3],其中一抗為小鼠抗高血糖素抗體(1:100)、兔抗高血糖素抗體(1:100),二抗為FITC-山羊抗小鼠抗體(1:100)、FITC-山羊抗兔抗體(1:100)。

          結果

          1、脫水時程過短或過長均致組織碎裂

          95%、100%乙醇脫水,時間過短致透明不全,時間過長致組織變脆,過短、過長皆導致切片時組織碎裂不能成型。如95%乙醇5/10min×2次、100%乙醇4min×2次時小鼠胰腺透明不全;95%乙醇20min×2次、100%乙醇10min×2次時小鼠胰腺組織脆,難以切片成型。

          2、苯的透明效果較好

          二甲苯透明速度快,但8/10min×2次時已使胰腺組織變脆,嚴重影響切片質量;氯仿、苯透明速度較二甲苯慢,但15/20min×2次時已完全透明,且組織脆性尚可,切片成型、皺褶較少,不過氯仿透明的石蠟切片顯微鏡下可見許多蜂窩狀空洞(圖1A)。

          表1 不同時間對小鼠胰腺石蠟切片質量的影響
        表1 不同時間對小鼠胰腺石蠟切片質量的影響

          注:+表示切片質量一般,++表示切片質量尚可,+++表示切片質量佳

          Note:+poor quality,++medium quality,+++good quality

          3、石蠟切片的綜合時程效果

          95%乙醇15min×2次、100%乙醇6min×2次、苯15min×2次、浸蠟90min后石蠟包埋,切片時未出現組織過脆、破碎等現象,其切片質量較好、組織完整、皺褶較少,鏡下胰腺結構清晰(表1,圖1A)。

          為進一步優化切片質量,在上述實驗基礎上對各時間稍作微調,其結果顯示95%乙醇15min×2次、100%乙醇Ⅰ6min、100%乙醇Ⅱ7min、苯Ⅰ15min、苯Ⅱ18min、浸蠟90min時其切片質量最優(表1)。

          4、小鼠源抗體免疫染色1型糖尿病小鼠胰腺時易出現假陽性熒光

          1型糖尿病小鼠胰腺石蠟包埋時以氯仿透明,致使胰腺組織內出現許多空洞(圖1A)。以小鼠抗高血糖素抗體或PBS代替一抗+FITC-山羊抗小鼠抗體進行免疫熒光染色時,胰島周圍或胰腺淋巴組織內易出現假陽性的熒光染色(圖1B、1C);以兔抗高血糖素抗體進行免疫熒光染色時胰島呈陽性反應(圖1A),但鑒于1型糖尿病胰島常有淋巴細胞浸潤,為除外上述淋巴細胞假陽性染色的可能,以兔抗高血糖素抗體行胰腺(含淋巴組織)免疫熒光染色,胰腺淋巴組織內未見陽性熒光(圖1D)。

          圖1 1型糖尿病小鼠胰腺高血糖素免疫熒光染色。A,石蠟包埋時以氯仿透明,致使胰腺組織內出現許多空洞(一抗為兔抗高血糖素抗體);B,胰島周圍或胰腺淋巴組織內的假陽性染色(箭頭):無一抗(以PBS替代),二抗為FITC-山羊抗小鼠抗體;C,胰島周圍或胰腺淋巴組織內的假陽性染色(箭頭):一抗為小鼠抗高血糖抗體;D,無假陽性染色:一抗為兔抗高血糖素抗體;標尺,20μm
        圖1 1型糖尿病小鼠胰腺高血糖素免疫熒光染色。A,石蠟包埋時以氯仿透明,致使胰腺組織內出現許多空洞(一抗為兔抗高血糖素抗體);B,胰島周圍或胰腺淋巴組織內的假陽性染色(箭頭):無一抗(以PBS替代),二抗為FITC-山羊抗小鼠抗體;C,胰島周圍或胰腺淋巴組織內的假陽性染色(箭頭):一抗為小鼠抗高血糖抗體;D,無假陽性染色:一抗為兔抗高血糖素抗體;標尺,20μm

          Fig.1 Immunofluorescent staining for glucagon in the pancreas from type 1 diabetic mice.A,transparency by chloroform during paraffin embedding caused many cavities in the pancreatic tissue,rabbit anti-glucagon antibody as primay antibody;B,false-positive immunofluorescent staining around pancreatic islets or inside pancreatic lymphoid tissue(arrows):without primay antibody(replaced by PBS),FITC-conjugated goat-anti-mouse antibody as secondary antibody;C,false-positive immunofluorescent staining around pancreatic islets or inside pancreatic lymphoid tissue(arrows);mouse an-ti-glucagon antibody as first antibody;D,no false-positive immunofluorescent staining;rabbit anti-glucagon antibody as first antibody;scale bar,20μm

          討論

          脫水,即用脫水劑除去組織水分,并使組織進一步固化,為后續透明及浸蠟創造條件[3]。脫水不足,影響透明浸蠟效果;脫水過度,組織易脆,切片時組織難以成型,易碎裂。高濃度乙醇脫水效果強,但需嚴格控制時間,故本實驗探索了95%、100%乙醇脫水時間,尤其是100%乙醇脫水,以免脫水過度。諸多文獻表明[4,5],動物器官(切成0.5×0.5×0.5cm3左右)石蠟包埋時,95%乙醇、100%乙醇梯度脫水分別超過1h、甚至3h以上。本實驗中小鼠胰腺為非實體性器官,其梯度乙醇脫水時間與前述文獻不同,室溫下95%乙醇15 min×2次、100%乙醇Ⅰ6 min、100%乙醇Ⅱ7 min時效果最佳。

          苯、二甲苯以及氯仿等因混溶于乙醇及石蠟,故可應用于組織浸蠟前的透明。研究發現,透明可導致組織收縮、變硬、變脆,故須嚴格控制透明時間[6]。本實驗發現:二甲苯透明速度快,但8/10 min×2次時已使胰腺組織變脆,嚴重影響切片質量。故二甲苯透明作用雖強,但胰腺透明時不易控制時間,極易透明過度。已有實驗表明:苯在透明心、肝、肺和腦等器官(厚約0.3 cm)時,透明時間可達8 h左右,且透明效果好[7],故本實驗為更好把控透明時間,選用了苯或氯仿作為透明試劑,發現兩者透明效果較為緩和,時間可控,又能明顯減輕組織過脆的現象,但氯仿揮發性較強,透明組織內氯仿易揮發,致使組織浸蠟常常不充分,其切片染色后呈現諸多空洞。綜上,胰腺組織透明時應將苯作為首選透明劑。

          浸蠟是使石蠟逐漸置換透明劑,以達到支持組織的目的。浸蠟進一步提高了組織的硬度和脆性,同時浸蠟時間不足,組織內可留有孔洞,無法切出完整切片,故浸蠟時間仍需探索。本實驗中浸蠟時間1.5h為最優,以避免浸蠟不足,切片不完整,或浸蠟過度,組織過度收縮、變硬和變脆。

          以1型糖尿病小鼠胰腺進行研究時發現,利用小鼠抗高血糖素抗體進行免疫熒光染色時在胰島周圍或胰腺淋巴組織內呈現明顯的免疫熒光染色,為求進一步確認,本實驗又以兔抗高血糖素抗體進行免疫熒光染色,并未呈現前者的熒光,同時又以PBS替代一抗進行免疫染色時,也呈現了如小鼠抗高血糖素抗體免疫熒光染色時相似的染色結果,故推測在胰島周圍或胰腺淋巴組織內的陽性熒光染色為假陽性熒光染色。

          胰島炎癥,即胰島周圍和內部免疫細胞浸潤,為1型糖尿病病理標志。1型糖尿病小鼠胰腺組織中單核巨噬細胞、B淋巴細胞、部分T細胞等可含IgG[8],本實驗中FITC-山羊抗小鼠二抗便可與之特異性結合,導致假陽性染色。所以,1型糖尿病或胰腺炎時,為避免胰腺免疫組化染色的假陽性,應盡量避免選擇同種動物源的一抗等,同時實驗過程中常規做陽性、陰性對照,以明確陽性結果。

          參考文獻

          [1]袁亞婷,江岳鑫,尹小文,等.四種石蠟包埋組織DNA提取方法的比較.中國組織工程研究,2010,14(24):4430-4434.
          [2]嚴曉麗,杜夢楠,鄭紀寧.石蠟包埋組織在分子生物學實驗中的研究進展.中國老年學雜志,2018,38(22):247-250.
          [3]李如江,邱曙東,田宏,等.胰島α細胞量在糖尿病發展過程中的變化及其機制.四川大學學報(醫學版),2013,44(06):886-890,939.
          [4]何書海,陳宏智.一種快捷安全的動物病理組織石蠟切片制作技術.中國獸醫雜志,2012,45(1):15-17.
          [5]張彩麗,張俊霞,劉湘花,等.實驗動物多臟器組織石蠟切片統一制做流程及影響條件.臨床與實驗病理學雜,2019,35(1):108-109.
          [6]王偉,趙燦燦,姚煥玲,等. 18℃恒溫下,石蠟切片制作過程的脫水透明最佳時間探索.現代生物醫學進展,2013(7):1236-1239.
          [7]王立,袁芳.苯和二甲苯對組織塊透明效果的比較.解剖學雜志,2005,28(4):375-375.
          [8] Pugliese A. Insulitis in the pathogenesis of type 1 diabetes.Pediatric diabetes,2016,17(Suppl 22):31-36.

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