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        生物樣品包埋中兩種環氧樹脂的聯合應用
        發布時間:2019-11-05

          摘    要: 應用透射電鏡觀察組織細胞的超微結構是生物醫學研究的重要手段。成功包埋樣品是成功制備超薄切片和獲得清晰圖像的先決條件。分別使用Spon812和Spurr兩種環氧樹脂對某些特殊生物樣品進行包埋,并與聯合使用兩種樹脂包埋的效果進行了比較,結果顯示,Spon812樹脂包埋的樣品可獲得反差顯著的電鏡圖像,但對某些致密組織浸透不良,有空洞或褶皺形成;Spurr樹脂包埋樣品的浸透良好,尤其適合作為神經組織包埋劑,但圖像反差較弱;聯合使用兩樹脂包埋樣品的浸透良好,圖像反差介于兩者之間。因此,聯合使用兩種樹脂可以綜合它們的優點,適合絕大多數生物樣品的批量包埋。

          關鍵詞: 透射電鏡樣品制備; 包埋劑; 特殊樣品;

          Abstract: Epoxy resins Spon 812 and Spurr are two common embedding medium on the TEM samples.The comparison result shows that the ultrastructural images of specimens embedded into Spon812 resin appear with high contrast,but the resin mixture penetration is not completed on some special tissues and some small cavities and folds are found on ultrathin sections.The specimens embedded into Spurr is highly efficient for penetration and appropriate for nerve tissues,but images contrast is lower than that of Spon812 resin.When Spon 812 and Spurr are combined used to embed specimens,the result is satisfied with good resin penetration and proper images contrast.This method is suitable for most of TEM biological specimens.

          Keyword: TEM sample preparation; Epoxy resins; Special biological specimens;

          環氧樹脂是透射電鏡生物樣品制樣過程中應用最為廣泛的包埋劑,為制備電鏡樣品提供支撐,同時起到保護樣品超微結構的作用。其中Epon812和Spurr樹脂是最為常用的兩種樹脂,已經應用幾十年之久。Epon812樹脂是應用最為廣泛的環氧樹脂,具有無可比擬的優勢,例如樹脂塊兒聚合后體積縮小較少;對細胞超微結構保存良好;在超薄切片制備過程中具備優越的切割性能;超薄切片電鏡下觀察圖像呈現高度反差等[1]。但Epon812樹脂易吸收水分,且粘度較高,25℃下粘度為150~210cP[2]。Spon812是Epon812的直接替代產品,具有與Epon812相同的特點。與812樹脂相比,Spurr樹脂是一種粘度相對更低的樹脂,混合樹脂也只有60cP[2],不易吸收水分,但其毒性較大,價格昂貴。Spurr樹脂包埋的樣品比Epon812更易于切片,但超薄切片鏡下觀察反差較弱[3]。有研究者建議將兩種樹脂混合使用,可達到良好的包埋效果[4]。

          本實驗室經過長時間使用Spon 812樹脂和Spurr樹脂進行透射電鏡樣品制備后發現,對于某些難于浸透的生物組織樣品例如中樞神經組織中的髓鞘、糖原堆積的肝臟組織、膠原纖維豐富的血管組織,Spon 812樹脂浸透不良現象時有發生。使用Spurr樹脂包埋,解決了浸透不良的問題,但在超薄切片制備時需要使用二甲苯或氯仿對超薄切片反復熏蒸使切片展平;另外使用定向包埋板包埋的Spurr樹脂塊聚合后松脆易斷,夏天尤為明顯,樣品的超微結構難以得到良好的保存。因此針對上述特殊樣品,本實驗室嘗試將兩種樹脂結合使用對特殊樣品進行浸透和包埋,通過電鏡觀察樣品超微結構,發現混合樹脂作為包埋劑使用聚合后樹脂塊硬度適中,易于超薄切片制備,樣品滲透效果良好,超微結構清晰,圖像襯度適中,同時具有兩種樹脂的優點,可作為日常樣品包埋劑使用。
         

        生物樣品包埋中兩種環氧樹脂的聯合應用
         

          1 、材料和方法

          1.1 、固定和取材

          實驗材料為具有糖、脂代謝模型小鼠的肝臟組織、正常小鼠腦組織、血管組織。實驗動物經2.5%戊二醛和4%多聚甲醛灌注固定,取分別取肝、腦和腹主動脈組織,肝、腦組織切成1mm3小塊,腹主動脈切成1mm長小段,采用2.5%戊二醛固定液于4℃冰箱固定2h,0.1MPB充分洗滌后待用。

          1.2、 組織后固定、脫水和包埋

          采用濃度1%四氧化鋨對上述組織進行后固定,溫度設置為4℃。固定后的組織經0.1MPB緩沖液清洗、乙醇梯度脫水后分為3組。第1組,采用Spon812樹脂(SPI-02660AB)浸透和包埋;第2組;采用Spurr樹脂(SPI-02680AB)浸透和包埋;第3組采用Spon812與Spurr按照1∶1混合的樹脂進行浸透和包埋。浸透液配制按丙酮與樹脂比例以1∶1,1∶3,各浸透1h,純樹脂浸透2h。包埋樹脂配方見表1、表2:

          表1 Spon812樹脂配方
        表1 Spon812樹脂配方

          表2 Spurr樹脂配方:
        表2 Spurr樹脂配方:

          按照上述配方分別配制Spon812和Spurr樹脂,然后分別取等量體積的樹脂充分混合后用于第3組樣品組織浸透和包埋。

          各組樣品入包埋板后,分別加入相應新樹脂。聚合過程和溫度設置為37℃,過夜;45℃,8h;70℃,24h。

          1.3、 修塊、超薄切片和染色

          樹脂聚合后,包埋塊經修塊后用Leica UC6超薄切片機進行超薄切片制備,片厚75nm,超薄切片經常規檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后進行透射電鏡觀察。

          1.4、 電鏡觀察

          使用日本電子JEM2100型透射電鏡觀察3組包埋樣品,拍照圖像的條件和放大倍數相同。

          2、 結果

          2.1、 修塊和超薄切片制備比較

          修塊過程中發現用不同樹脂制備的包埋塊硬度存在差異,SPI-Pon812樹脂塊硬度較高,修塊最為困難;Spurr樹脂塊硬度最低,容易切割;混合樹脂則硬度和韌性介于兩者之間。超薄切片制備過程中發現,SPI-Pon812樹脂和混合樹脂包埋樣品易于制備超薄切片,腦組織和肝臟組織超薄切片舒展平整,血管超薄切片需要氯仿熏蒸展片。Spurr樹脂包埋的組織樣品制備的超薄切片大多需要使用氯仿熏蒸展片。

          2.2、 電鏡觀察結果比較

          肝臟組織在電鏡下可見肝細胞內大量糖原堆積(圖1)。Spon812樹脂包埋樣品可見圖像反差最顯著,糖原聚集處可見樹脂浸透不良產生的小空洞;Spurr樹脂包埋樣品浸透良好,但圖像反差小,膜結構清晰可見;混合樹脂包埋樣品浸透良好,圖像反差介于兩種樹脂單獨使用之間,超微結構清晰程度優于兩種樹脂單獨使用包埋樣品獲得的圖像結果。

          腦組織在電鏡下可見髓鞘結構和大量神經纖維和突觸構成的神經氈結構(圖2)。Spon812樹脂包埋樣品髓鞘結構顯著浸透不良,多見透亮空洞;突觸結構、突觸內小泡和膜結構可見。Spurr樹脂包埋樣品浸透良好,圖像反差良好,可見粗面內質網、突觸、突觸小泡等非常清晰的結構,神經纖維內可見橫切或縱切的微管結構。混合樹脂包埋樣品具有和Spurr樹脂包埋樣品相似的觀察結果,兩者觀察效果皆優于單獨使用Spon812樹脂包埋樣品獲得的圖像。

          血管組織超微結構有明顯的分層,可見血管內皮細胞、內皮下層和內彈性膜、平滑肌細胞等,含有大量膠原纖維和彈性纖維(圖3)。Spon 812樹脂包埋樣組樣品樹脂浸透不均勻,在內皮下層和內彈性膜層超薄切片可見大量褶皺形成。Spurr樹脂包埋樣品組樹脂浸透均勻,超薄切片幾乎沒有褶皺形成。而混合樹脂包埋樣品組浸透良好,超薄切片偶見褶皺,不影響超微結構的觀察,本組超薄切片拍攝圖像反差優于Spurr樹脂包埋組。

          圖1 糖脂代謝障礙模型小鼠肝組織超微結構圖像
        圖1 糖脂代謝障礙模型小鼠肝組織超微結構圖像

          a、b圖,Spon 812樹脂包埋的肝組織超微結構圖像,b圖為a圖局部放大,圖像反差顯著,糖原聚集處可見樹脂浸透不良產生的透亮空洞,如箭頭所示;可見粗面內質網、線粒體和細胞核著色較深,可見核膜。白色三角示粗面內質網,空三角示核膜,箭頭所示為空洞;c、d圖,Spon 812和Spurr樹脂聯合使用包埋的肝組織超微結構圖像,d圖為c圖局部放大,圖像反差良好;糖原聚集處可見樹脂浸透均勻,粗面內質網及內質網上的核糖體(白三角所示)和核膜結構(空三角所示)非常清晰;e、f圖,Spurr樹脂包埋的肝組織超微結構圖像,f圖為e圖局部放大,圖像反差較弱,糖原聚集處可見樹脂浸透均勻,粗面內質網(白三角所示)和核膜結構(空三角所示)可見,但反差弱,不清晰。(a、c、e圖Bar=1μm,b、d、f圖Bar=0.2μm)。

          圖2 正常小鼠小鼠腦組織超微結構圖像
        圖2 正常小鼠小鼠腦組織超微結構圖像

          a、b圖,Spon 812樹脂包埋的腦組織超微結構圖像,圖像整體反差顯著,a圖為髓鞘結構,可見樹脂浸透不良產生的透亮空洞,如箭頭所示;b圖為高倍鏡下神經纖維和突觸超微結構,白色三角示突觸結構內的突觸小泡;c、d圖,Spon 812和Spurr樹脂聯合使用包埋的腦組織超微結構圖像,圖像反差適中,c圖可見髓鞘結構樹脂滲透均勻,未見空洞,d圖可見突觸超微結構較Spon 812包埋組織的圖像結構清晰,可見箭頭所示神經纖維中的微管;e、f圖,Spurr樹脂包埋的腦組織超微結構圖像,圖像反差滿意,e圖可見髓鞘結構樹脂浸透良好,f圖可見白三角所示的突觸結構和突觸小泡,箭頭所示為神經纖維中橫切或縱切的微管,超微結構清晰且精細,易于辨認。(a、c、e圖Bar=1μm,b、d、f圖Bar=0.2μm)。

          圖3 小鼠腹主動脈血管組織超微結構圖像
        圖3 小鼠腹主動脈血管組織超微結構圖像

          a、b圖,Spon 812樹脂包埋的血管組織超微結構圖像,b圖為a圖局部放大,在內膜下層和內彈性膜層可見由于樹脂滲透不均產生的褶皺,如箭頭所示;c、d圖,Spon 812和Spurr樹脂聯合使用包埋的血管組織超微結構圖像,d圖為c圖局部放大,樹脂滲透較好,圖像反差良好;e、f圖,Spurr樹脂包埋的血管組織超微結構圖像,f圖為e圖局部放大,樹脂浸透均勻,圖像反差弱于樹脂聯合使用組。(a、c、e圖Bar=2μm,b、d、f圖Bar=0.2μm)。

          3、 討論

          用于臨床診斷、研究以及科研觀察的樣品具有復雜多樣的特點,某些樣品在結構組成上存在一些特殊性,需要特殊對待處理。這就與日常工作中常規進行批量化樣品包埋處理形成矛盾,導致電鏡觀察時才發現各種問題,其中樹脂浸透不佳的問題最為多見,產生空洞或褶皺,影響超微結構觀察,降低了圖片質量。因此需要對包埋樹脂進行一些簡單易行的改進,使其兼顧普通樣品和特殊樣品的制樣要求。

          Spon 812樹脂和Spurr樹脂是透射電鏡樣品制備最為常用的兩種環氧樹脂,二者具有相似的切割性能。Spon812適用于大多數于動物組織、細胞樣品的包埋;Spurr多用于難浸透植物樣品的包埋。Spon812樹脂包埋樣品硬度和韌性均高于Spurr,容易制備較大超薄切片,切片平整,不需要二甲苯熏蒸展片,操作難度低。但該樹脂粘度大,硬度高的特點也給樣品制備帶來問題,對于某些特殊樣品,如本實驗室在工作中遇到的質地緊密、富含髓磷脂的髓鞘板層結構、富含彈性纖維和膠原纖維的血管結構,以及糖原堆積的肝臟組織,都發現樹脂滲透效果不佳。Spurr樹脂包埋樣品浸透效果好,易于切片,超微結構清晰精細,尤其適合作為神經組織樣品的包埋劑使用。但經該樹脂包埋的肝臟組織超薄切片在鏡下觀察反差較弱。另外,Spurr樹脂價格昂貴,具有較強毒性,夏天使用時發現聚合后的樹脂塊酥脆易碎,在定向包埋板中聚合的樹脂塊尤其明顯,包埋后的組織樣品超微結構遭到破壞,影響觀察。在超薄切片制備過程中發現,Spurr樹脂包埋樣品的超薄切片展片效果不佳,多需二甲苯或氯仿熏蒸促使超薄切片展平,長期使用對操作人員的健康有不良影響。

          本實驗室將分別配制的兩種基礎樹脂按照1∶1體積比混合后使用可以解決特殊樣品浸透不良的問題,同時避免了Spurr樹脂單獨使用時超薄切片展片的問題。

          電鏡樣品制備受環境因素影響較大,不同季節、不同濕度、不同實驗室,均導致環境存在差異,不同的樣品類型也具有不同的特點,因此需要具體問題具體分析,有針對性的調整樹脂配比的比例來滿足特殊需求。

          4、 結論

          將兩種樹脂按一定比例混合用于樣品包埋既可以兼具兩種樹脂各自的優點,又能克服兩種樹脂各自的缺點。通過發揮它們的綜合優勢,可極大地提高常規批量多種生物組織包埋的效率。對于難浸透的樣品和圖像反差小的樣品,可單獨使用Spurr或Spon 812樹脂來滿足包埋這些特殊樣品的需求。

          參考文獻

          [1]Finck H.Epoxy resins in electron microscopy.J Biophys Biochem Cytol,1960,7(2):27-30.
          [2]鄭國閟,谷祝平.生物顯微技術,第2版[M].北京:高等教育出版社.
          [3]Wallis M A,Griffin R L A.A routine method for embedding animal tissues in Spurr resin for electron microscopy.J Clin Pathol,1973,26(1):77-8.
          [4]謝慶春,劉德勝.對某些難浸透材料的一種簡單可行的包埋方法[J].電子顯微學報,1988(03):129.

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