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        冷凍切片HE染色染液質控最佳方法探討
        發布時間:2018-11-27

          摘    要: 目的 探索一種較佳的病理快速冷凍切片染色質控片的制備方法。方法 隨機抽取60例快速冷凍組織, 每例取2塊組織, 隨機分為A、B二組, 在-25℃速凍后, A組 (標準組) 切片放入AAF液 (由95%乙醇A、乙酸A、甲醛F按85:5:10的比例配制而成) 固定30s后立即進行HE染色, B組切片放入AAF液固定30s后取出室溫晾干后放進冷凍切片機內過夜。余下的A組及B組組織進行后續2種不同的操作。C組:得到A組切片后的組織不做任何處理, 直接放冷凍切片機機箱內, 并將冷凍切片機箱體溫度調高至-10℃, 第二天上午再次調至-25℃;D組:得到B組切片后的組織于組織上加包埋劑覆蓋后放冷凍切片機機箱內, 余操作同C組。C、D兩組于第二天上午8點再次進行冷凍切片后同B組一同進行HE染色, 以十分制評定切片有無裂隙、皺褶或冰晶, 染色后組織結構、細胞核著色和核質對比清晰度等6項指標的得分, 分別與A組的染色片進行比較。結果 A、B兩組切片質量評價指標得分無明顯差別, C組切片無裂隙指標得分低于A組, D組無冰晶指標得分低于A組;B、C兩組的組織結構清晰、細胞核鮮艷、核質對比清晰指標得分與A組比較無顯著差異;D組組織結構清晰、細胞核鮮艷、核質對比清晰指標得分均低于A組。結論 新鮮的組織冷凍切片后, 切片立即放入AAF液固定30s, 隨后取出, 常溫晾干后再次放進冷凍切片機機箱內過夜直至第二天上午放入全自動染色機內進行HE染色, 觀察染液的染色力, 適用于每天快速冷凍切片工作開展前的全自動染色機的染色質控。

          關鍵詞: 快速冷凍切片; 染色質控片;
         

        冷凍切片HE染色染液質控最佳方法探討
         

          Abstract: Objective To explore a better preparation method of quality control slides for pathological rapid frozen section staining. Methods 60 cases of rapid frozen tissues, including thyroid tissue, breast tissue and lung tissue (20 cases each tissue) , were randomly selected. Two tissue samples taken from each case were divided randomly into group A and group B (that is, 60 tissue samples each group) . After rapidly frozen in the freezing microtome with a setting temperature-25℃, the tissue blocks were cut to obtain one section from each sample. The sections from group A (Control A) were put into AAF solution (prepared in a ratio of 85:5:10 with 95% ethanol, acetic acid and formaldehyde) and fixed for 30 s and stained with HE immediately, while the sections from group B (Control B) were put into the freezing microtome overnight after 30 s' fixation and then dried at room temperature. The remaining tissues from group A and B were carried out the following operations. The tissues for Control C were obtained from group A and placed directly in the freezing microtome without any other treatment, in which the temperature was raised to-10℃ and adjusted from-10℃ to-25℃ at 8:00 a.m. the next day (after 15 hours) . The tissues for Control D were obtained from group B and covered with embedding reagent, then placed in the freezing microtome, and the rest operations were the same as Control C. After frozen sectioning again, the sections of Control C and D were stained together with the sections of Control B with HE at 8:00 a.m. the next day. The scores of the six indexes, including no crack, no wrinkles, no ice crystal, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm were evaluated by a 10-point scale, each of which was respectively compared with that of Control A. Results There was no significant difference in the scores of no crack, no wrinkle or no ice crystal indexes between Control A and B; while the scores of no crack index in Control C and the scores of no ice crystal index in Control D were lower than those in Control A. Compared with Control A, there was no statistically significant difference in the scores of clear tissue structure, bright nucleus or clear contrast between nucleus and cytoplasm index in Control B and C, while the scores of clear tissue structure, bright nucleus or clear contrast between nucleus and cytoplasm in Control D were all lower than those in Control A. Conclusion The procedure that, making frozen slices with fresh tissue, putting the frozen sections into the AAF solution immediately for 30 s, and taking them out to dry at room temperature, then placing the sections in the freezing microtome overnight until the next morning at 8 a.m. followed by HE staining in a fully automatic staining machine to observe the dyeing effect of the staining solution, is suitable for the quality control of automatic staining machine before the daily pathological rapid frozen section staining.

          Keyword: Rapid frozen section; quality control slides for staining;

          冷凍切片是快速將組織冷凍成一定的硬度、切出薄片的過程[1]。隨著對術中冷凍切片的深入研究, 目前術中冷凍切片已經廣泛應用于病理診斷中[2,3]。病理冷凍切片制作質量的好壞, 會影響病理醫生的診斷準確性。在有限的時間內又快又好地完成冷凍切片的制片, 不僅是病理診斷的需要, 更是術中外科醫師的迫切要求[4]。近年來, 隨著各種檢測技術不斷實現現代化, 全自動染色機已逐漸應用于快速冷凍切片HE染色中, 而病理技術工作者面臨著如何對冷凍切片染色機內的染液進行質控的難題。以往全自動染色機應用于組織脫水處理后的常規HE切片的染色時, 只需將常規HE切片放進染色機內, 依照染色結果對機內的染色液進行調整。冷凍切片的染色液種類及其流程與常規HE切片染色無異, 但兩者的染色時間顯著不同, 常規HE切片不能用于冷凍切片染色程序染液的質控。冷凍切片制片過程中, 如果染液未做好質控, 冷凍切片染色效果不佳時, 再來調整染色機內染液, 重新進行冷凍切片與染色就將顯著延長冷凍切片出片時間, 嚴重影響病理診斷及時率并拖延手術的等待時間。故筆者通過實驗, 旨在探索一種較佳的冷凍切片HE染色染液質控方法。

          一、材料與方法

          1、 材料

          隨機抽取2017年9月至2017年12月廈門大學附屬第一醫院病理科的快速冷凍切片標本60例, 其中甲狀腺組織20例, 乳腺組織20例及肺組織20例。患者性別及年齡無限制。

          2、 主要設備

          LEICA CM1950冷凍切片機 (德國萊卡) ;DAKEWE (達科為) 全自動染色機。

          3、 主要試劑

          包埋劑, AAF液 (由95%乙醇A:乙酸A:甲醛F=85:5:10組成) , 新鮮配制的Harri蘇木素染液, 1%鹽酸乙醇液, 飽和碳酸鋰溶液, 0.5%酸化伊紅, 75%乙醇, 85%乙醇, 95%乙醇, 無水乙醇。

          4、 取材

          新鮮送檢組織取材大小約為1.5cm×1.5cm×0.3cm, 每一個病例取2塊組織, 隨機分為A、B兩組 (每組60塊) , 所有組織塊切取后均立即放置于冷凍切片機托頭上, 加適量的包埋劑, 將托頭連同組織放置于已預先設置至-25℃的凍臺上速凍。

          5、 冷凍切片的制作

          為保證實驗更加準確, 實驗切片的制作都采用新刀片。

          5.1、 A組切片制備

          A組組織用冷凍切片機各切取一張厚度為5~6μm的冷凍切片, 立即放入AAF液固定30s, 然后置于染液已經質控的DAKEWE全自動染色機內進行HE染色:水洗5s→新鮮配制的Harri蘇木素染液90s→自來水沖洗15s→1%鹽酸乙醇液1s→自來水沖洗1s→飽和碳酸鋰溶液4s→自來水沖洗15s→0.5%酸化伊紅2s→自來水沖洗15s→75%乙醇2s→85%乙醇2s→95%乙醇1s→無水乙醇1s, 染色結束后吹干, 中性樹膠封片。

          5.2、 B組切片制備

          B組組織用冷凍切片機各切取一張厚度為5~6μm的冷凍切片, 立即放入AAF液固定30s, 隨后取出, 室溫晾干后再次放進冷凍切片機機箱內, 第二天上午8點取出, 然后置于DAKEWE全自動染色機內進行染色, 染色方法同A組。

          5.3、 C組切片制備

          得到A組切片后的組織, 不做任何處理, 直接放置于冷凍切片機機箱內, 調節冷凍切片機箱溫至-10℃直至第二天上午8點, 再將冷凍切片機凍臺設置至-25℃、夾頭溫度設置至-17℃后, 用冷凍切片機再各切取一張厚度為5~6μm的冷凍切片, 立即放入AAF液固定30s, 然后置于染液已經質控的DAKEWE全自動染色機內進行染色, 染色方法同A組。

          5.4、 D組切片制備

          得到B組切片后的組織, 于組織上加適量包埋劑覆蓋后, 放冷凍切片機機箱內, 其余操作同C組。

          6、 冷凍切片質量觀察指標

          切片質量評價:觀察切片的組織裂隙、皺褶和冰晶, 以10分制評分。評分標準:若切片的組織無裂隙、無皺褶、無冰晶, 則每項指標得分均為10分;若切片上X%面積的組織出現相應的指標, 則該指標得分為10-X/10。例如, 某切片上25%面積的組織有裂隙, 則該切片裂隙指標得分為10-25/10=7.5分。以此類推。

          染色效果評價:觀察各組切片染色后組織結構、細胞核著色和核質對比清晰度, 以10分制評分。評分標準:若切片組織結構清晰、細胞核鮮艷、核質對比清晰, 則每項指標得分均為10分;若切片組織結構輕度模糊, 尚不影響觀察, 減1~2分;組織結構模糊, 一定程度的影響觀察, 減3~6分;組織結構模糊不清, 嚴重影響觀察, 減7~10分。2名高級質控師進行雙盲評片, 每項指標的數據為評分的均值。結果采用?±s表示。

          7、 全自動染色機染液質控方法

          選取待染冷凍切片放入全自動染色機內進行HE染色, 染色完成后, 鏡下觀察切片染色質量, 染色效果好 (組織結構清晰、細胞核鮮艷、核質對比清晰) 則無需對染液進行更換或調整染色時間, 可直接進行后續的快速冷凍切片染色;若鏡下觀察切片染色質量差, 則需針對染色結果, 進行相應的染液更換或調整染液染色時間, 再進行一次質控測試, 直至測試結果顯示染色效果好為止。

          8、 統計學分析

          采用SPSS 17.0軟件進行統計分析, 數據以±s表示。將B、C、D 3組冷凍切片的切片質量與染色效果各項指標分別與A組進行比較, 2組間比較采用t檢驗, P<0.05為差異有統計學意義。

          二、結果

          1、冷凍切片切片質量的比較

          不同制備方法所制冷凍切片無裂隙、無皺褶、無冰晶指標得分情況見表1。A、B兩組切片的裂隙、皺褶、冰晶指標得分比較, 差異均無統計學意義 (P>0.05) ;C組切片裂隙指標得分低于A組, 差異有統計學意義 (P<0.01) ;D組切片后組織冰晶指標得分低于A組, 差異有統計學意義 (P<0.01) 。A組染色片 (圖1A) 無裂隙、無皺褶、無冰晶;B組染色片 (圖1B) 無裂隙、無皺褶、無冰晶;C組染色片 (圖1C) 有裂隙、無皺褶、無冰晶;D組染色片 (圖1D) 無裂隙、無皺褶、有冰晶。

          表1 4組冷凍切片質量評價得分Tab.1 4 groups of frozen sections quality evaluation scores
        表1 4組冷凍切片質量評價得分Tab.1 4 groups of frozen sections quality evaluation scores

          與A組比較:a P<0.01Compared with group A:a P<0.01

          2、冷凍切片染色效果的比較

          4組冷凍切片染色效果評分結果顯示, B、C 2組組織結構清晰、細胞核鮮艷、核質對比清晰指標得分分別與A組比較, 差異均無統計學意義 (P>0.05) ;D組組織結構清晰、細胞核鮮艷、核質對比清晰指標得分均分別低于A組, 差異均有統計學意義 (P<0.05) 。A組染色片 (圖1A) 組織結構清晰、細胞核鮮艷、核質對比清晰;B組染色片 (圖1B) 組織結構清晰、細胞核鮮艷、核質對比清晰;C組染色片 (圖1C) 組織結構清晰、細胞核鮮艷、核質對比清晰;D組染色片 (圖1D) 組織結構欠清晰、細胞核不鮮艷、核質對比不清晰。

          表2 4組冷凍切片染色效果評分結果Tab.2 4 groups of frozen sections staining effect score
        表2 4組冷凍切片染色效果評分結果Tab.2 4 groups of frozen sections staining effect score

          與A組比較:b 0.01<P<0.05Compared with group A:b 0.01<P<0.05

          三、討論

          快速冷凍切片主要用于病理醫師對臨床手術病人在術中的快速病理診斷, 是確定某些“低風險”病理參數的一般可靠工具[5], 方便外科手術醫師在此基礎上決定手術方案、范圍及治療方法, 故為了能更好、更快地將病理快速冷凍報告發給臨床手術醫師, 快速制作一張質量好的冷凍切片至關重要。

          作者實踐發現, 與傳統手工染色方法比較, 全自動染色機應用于病理科的快速冷凍切片HE染色具有以下優勢: (1) HE染色質量穩定。 (2) 省時省力。單片染色耗時上, 全自動染色機與傳統手工染色相比無明顯差異, 但前者能同時進行大批量染色, 而且節省人力[6], 技術人員可進行下一臺快速冷凍的制片。 (3) 安全環保。全自動染色機在密閉的空間內完成染色操作, 大大減少了試劑的揮發性刺激, 同時也減輕對工作人員的化學危害及環境的污染[7]。

          日常冷凍切片進行全自動HE染色過程中, 我們常遇到如下問題: (1) 未進行冷凍切片染色前, 染色機內染液的染色能力不能預知。 (2) 更換冷凍切片染色機內的蘇木素、分化液、返藍液或伊紅等染液后, 如果沒有進行試染, 其染色效果未知。 (3) 調整冷凍切片染色機內染液的染色時間后, 如果沒有進行試染, 其染色效果未知。以上三個問題任何一個未處理好, 將有可能使得染出來的冷凍切片染色效果不佳, 而此時再來調整染色機內染液, 重新進行冷凍切片與染色就將大大延長冷凍切片出片時間。有了質量可靠的冷凍切片待染片, 在每天臨床需進行快速冷凍切片的組織送至病理科前, 病理技術工作者有充裕的時間將冷凍切片待染片放入全自動染色機內進行HE染色, 通過鏡下觀察冷凍切片染色質量。當出現冷凍切片染色質量差的問題, 如組織結構不清晰、細胞核暗灰或核質對比不清晰, 則對蘇木素、分化液, 反藍液或伊紅染液進行相應的更換, 或者對相應染液的染色時間進行調整。調整后再進行一次質控測試, 若測試結果滿意, 則質控工作完成;若仍有染色質量問題, 則再進行下一次質控測試, 直至測試結果顯示染色效果好為止。因此, 制作質量可靠的病理冷凍切片預染片至關重要。

          為了探索一種較佳的病理冷凍切片染色質控片, 作者通過對比實驗發現, B組實驗得到的冷凍切片經過HE染色后, 切片質量及染色效果均與A組 (標準組) 相當, 且優于C、D組。B組實驗方法具有以下優點: (1) 質量可靠; (2) 簡便易行; (3) 通過保障病理冷凍切片質量, 避免患者在手術臺上花過多時間等待病理冷凍切片報告, 減少并發癥; (4) 通過質控, 進一步探索全自動染色機染多少片后需進行染液調換, 或幾天后染液衰退需進行更換, 以逐漸達到標準化。實驗過程中, 筆者發現本實驗缺乏室間質控這一缺點, 我院病理科作為該市的病理質控中心, 還需不懈努力, 進一步推進這一工作。

          圖1 4組冷凍切片HE染色 (同一患者甲狀腺和肺組織) 。A組切片無裂隙, 無皺褶, 無冰晶, 組織結構清晰, 細胞核鮮艷, 核質對比清晰;B組切片無裂隙, 無皺褶, 無冰晶, 組織結構清晰, 細胞核鮮艷, 核質對比清晰;C組切片有裂隙 (箭頭所示) , 無皺褶, 無冰晶, 組織結構清晰, 細胞核鮮艷, 核質對比清晰;D組切片無裂隙, 無皺褶, 有冰晶 (箭頭所示) , 組織結構欠清, 細胞核染色欠佳, 核質對比欠清;比例尺, 100μm Fig.1 HE staining of frozen sections in 4 groups (thyroid and lung tissues of the same patient) .Group A, it showed no crack, no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm;group B, it showed no crack, no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm;group C, it showed crack (indicated by the arrow) , no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm;group D, it showed no crack, no wrinkles, ice crystals (indicated by the arrows) , unclear tissue structure, no bright nucleus, and unclear contrast between nucleus and cytoplasm;scale bar, 100μm
        圖1 4組冷凍切片HE染色 (同一患者甲狀腺和肺組織) 。A組切片無裂隙, 無皺褶, 無冰晶, 組織結構清晰, 細胞核鮮艷, 核質對比清晰;B組切片無裂隙, 無皺褶, 無冰晶, 組織結構清晰, 細胞核鮮艷, 核質對比清晰;C組切片有裂隙 (箭頭所示) , 無皺褶, 無冰晶, 組織結構清晰, 細胞核鮮艷, 核質對比清晰;D組切片無裂隙, 無皺褶, 有冰晶 (箭頭所示) , 組織結構欠清, 細胞核染色欠佳, 核質對比欠清;比例尺, 100μm Fig.1 HE staining of frozen sections in 4 groups (thyroid and lung tissues of the same patient) .Group A, it showed no crack, no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm;group B, it showed no crack, no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm;group C, it showed crack (indicated by the arrow) , no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm;group D, it showed no crack, no wrinkles, ice crystals (indicated by the arrows) , unclear tissue structure, no bright nucleus, and unclear contrast between nucleus and cytoplasm;scale bar, 100μm

          實驗過程中發現, 冷凍后的組織塊, 如果表面裸露, 經過冷凍過夜, 組織表面干燥, 組織容易出現裂隙, 尤其以甲狀腺等細胞成分極為豐富的組織或肺等甚為疏松的組織更為顯著, 但組織染色效果并不受影響。冷凍組織表面裸露后再加包埋劑后, 再置于冷凍切片機內冷凍, 其切片較平整, 裂隙及皺褶少, 但冰晶較明顯, 組織染色質量下降, 尤其以疏松組織為甚, 筆者認為這可能是冷凍組織被包埋劑復溫溶化, 再次被冷凍切片機的凍臺冷凍, 當細胞外液開始結冰時, 細胞內還沒結冰, 細胞外液電解質濃縮, 導致滲透壓急劇升高, 細胞內水分子滲出細胞, 在細胞外形成冰晶, 有待更多的實驗證明。

          日常冷凍切片工作中, 染色的質控最主要通過細胞核及細胞質染色來了解染液的質量, 故筆者認為新鮮的組織冷凍切片后, 切片立即放入AAF液固定30s, 隨后取出, 常溫晾干后再次放進冷凍切片機機箱內過夜直至第二天上午8點放入全自動染色機內進行HE染色, 觀察染液的染色力, 適用于每天快速冷凍切片工作開展前的全自動染色機的染色質控, 可供各病理科參考應用。

          參考文獻:

          [1]丁偉, 王德田.簡明病理學技術.杭州:浙江科學技術出版社, 2014:46.
          [2]Sala P, Morotti M, Menada MV, et a1.Intraoperative frozen section risk assessment accurately tailors the surgical staging in patients affected by early-stage endometrial cancer:the application of 2 different risk algorithms.Int J Gynecol Cancer, 2014, 24 (6) :1021-1026.
          [3]Wu C, Qu X, Mao Y, et a1.Utility of intraoperative frozen section in the diagnosis of periprosthetic joint infection.PLOS ONE, 2014, 19 (7) :e102346.
          [4]薛曉偉, 孫保存, 王偉, 等.首屆全國病理技術“華夏杯”冷凍切片總決賽結果分析.中華病理學雜志, 2016, 45 (6) :413-414.
          [5]Desouki MM, Li Z, Hameed O, et al.Intraoperative pathologic consultation on hysterectomy specimens for endometrial cancer:an assessment of the accuracy of frozen sections, “Gross-Only”evaluations, and obtaining random sections of a grossly“Normal”endometrium.Am J Clin Pathol, 2017, 148 (4) :345-353.
          [6]高鴿, 王連有, 張麗榮, 等.浸染式與滴染式HE染色工作站的應用對比.診斷病理學志, 2017, 24 (5) :392-393.
          [7]張鵬, 包磊, 任麗芳, 等.全自動染色機與手工染色的比較及其染色程序的改進.臨床和實驗醫學雜志, 2015, 31 (2) :224-225.

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