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        單基因遺傳病分子診斷技術的發展研究
        發布時間:2018-10-31

          遺傳病論文第三篇

          題目:單基因遺傳病分子診斷技術的發展研究


          摘要:單基因遺傳病 (monogenic disease) 指由單個或單對等位基因突變導致的疾病, 一般遵循孟德爾遺傳規律, 傳統的單基因遺傳病診斷通常依賴于系譜分析、生化、影像等手段。近年來, 分子診斷技術特別是高通量測序技術已經成為單基因遺傳病的主要診斷手段, 對單基因遺傳病的明確診斷、預防和指導治療發揮著越來越重要的作用。本文對40多年來單基因遺傳病分子診斷技術的發展進行回顧, 介紹其最新進展, 并展望其在單基因遺傳病未來的研究進展。

          關鍵詞:單基因遺傳病; 分子診斷; 高通量測序;

        遺傳病

          Advances in genetic diagnosis of monogenic diseases under high-throughput sequencing

          CAI Aojie XUE Shuwen KONG Xiangdong

          Center of Prenatal Diagnosis, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University

          Abstract:

          Monogenic diseases refer to diseases caused by a single gene or a single allele mutation that can be readily explained by mendelian inheritance. Traditional genetic diagnosis of monogenic diseases usually depends on pedigree analysis, biochemical, imaging, etc. In recent years, molecular diagnostic techniques, especially high-throughput sequencing technology, have become the primary diagnostic tool for monogenic diseases. These molecular techniques play an increasingly significant role in the diagnosis, prevention and treatment of monogenic diseases. In this review, the developments of molecular diagnostic techniques over the past 40 years in the context of monogenic diseases will be discussed, and the latest progress and its prospect on future research will be introduced.

          Keyword:

          Monogenic disease; Molecular diagnostics; High-throughput sequencing;

          單基因遺傳病 (monogenic disease) 指由單個或單對等位基因突變導致的疾病, 一般遵循孟德爾遺傳規律。目前, 人類已知的單基因病已經超過10 000種, 盡管單個病種的發病率很低, 通常被稱為罕見病, 但是因種類多, 在人群中仍有著大約1/100的總體發病率[1], 因此罕見病其實并不罕見。很長一段時間里, 受技術所限, 單基因病既不能防, 也不能治。隨著分子生物學技術的發展, 越來越多的單基因病可以預防, 有的也可以治療, 甚至基因治療。而基因診斷或稱分子診斷成為單基因遺傳病防治的主要前提手段之一。

          分子診斷是當代醫學發展的重要前沿領域之一, 其核心技術是基因診斷。最早的分子診斷技術是Southern[2]于1975年發明的DNA印跡技術。1976年, 美籍華裔科學家簡悅威成功應用液相DNA分子雜交技術實現了鐮形細胞貧血癥的基因診斷[3], 是人類遺傳病診斷開始進入分子診斷時代的重要里程碑。隨著高通量測序技術的發展, 適用于單基因遺傳病的臨床分子診斷技術得到迅速發展。本文回顧了傳統的單基因遺傳病基因診斷方法和以高通量測序為代表的分子診斷方法的研究進展, 以期為臨床遺傳病診斷工作提供一些有益的參考。

          1 單基因遺傳病分子診斷的應用

          目前分子診斷在單基因遺傳病臨床工作中的主要應用包括6個方面: (1) 臨床確診診斷, 通過分子診斷鑒定或鑒別單基因病已成為臨床常規工作, 最常見的是小兒內科、神經內科、內分泌科、腎病科等, 分子診斷在一定程度上已經可以取代常規的診斷, 例如脊肌萎縮癥 (spinal muscular atrophy, SMA) 的基因診斷, 杜氏肌營養不良癥 (Duchenne muscular dystrophy, DMD) 的基因診斷都已經成為了一線診斷。 (2) 癥狀前遺傳學診斷, 某些遺傳代謝病或遲發性遺傳病如果早發現、早治療, 對于避免致病、致殘十分重要。例如肝豆狀核變性 (hepatolenticular degeneration, HLD) 家庭, 患者如果早期發現并及時進行驅銅治療則可以避免發病, 而通過分子診斷可以實現早期診斷, 有助治療。 (3) 新生兒遺傳代謝病篩查, 大多數新生兒疾病為單基因遺傳病, 但這些嚴重遺傳病的表型大多相似, 難以通過常規方法鑒定或鑒別, 通過新生兒遺傳代謝病或先天性免疫缺陷癥的分子診斷, 可以及時診斷遺傳病, 讓醫生和家屬少走彎路, 并且可對下次妊娠提供科學咨詢。 (4) 產前診斷, 通過孕早、中期的胎兒絨毛、胎兒羊水的DNA的分子診斷, 可以明確胎兒是否為遺傳病患者。 (5) 胚胎植入前遺傳學診斷, 單基因遺傳病家系在孕婦進行胚胎植入前, 對胚胎進行分子診斷來選擇健康的胚胎進行植入, 可避免孕中期產前診斷時如確診為患胎時所帶來的治療性流產的痛苦選擇。 (6) 孕前或群體單基因遺傳病篩查, 隱性遺傳病具有生育突發性、隱蔽性的風險, 孕前進行夫婦雙方的隱性遺傳病攜帶者篩查, 可使隱性遺傳病攜帶者夫婦避免生育隱性遺傳病患兒。

          2 常規單基因遺傳病分子診斷技術

          2.1 Southern印跡技術 (Southern blot)

          Southern于1975年發明了DNA印跡技術。Southern blot是最為經典的DNA分子檢測方法, 曾廣泛運用于各種基因突變的檢測, 包括缺失、插入、易位等, 因步驟繁瑣、電離輻射等缺點逐步退出了主流的檢測領域, 但其對面肩肱肌營養不良的基因診斷尚不能被替代[4], 除此之外, 近年來很少見到有其他單基因遺傳病應用Southern印跡技術進行診斷的報道。

          2.2 聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction, PCR)

          PCR技術由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1985年建立[5], 已經成為核酸分子擴增檢測最常用的方法。在單基因遺傳病分子診斷中, 有些基因突變如大片段缺失可直接采用PCR技術進行檢測, 例如DMD基因大片段缺失的男性患者可直接經PCR擴增后采用瓊脂糖電泳檢測技術進行DMD的分子診斷[6]。目前PCR技術主要作為常規基因診斷的前期必要步驟, 如多重連接探針擴增技術 (multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) 、Sanger測序、芯片雜交等的基礎步驟, 因此PCR是許多分子診斷技術的基礎方法, 目前是分子診斷實驗室的主流技術之一。

          2.3 多重連接探針擴增技術 (MLPA)

          MLPA技術于2002年由Schouten等[7]首先報道, 是一種能夠在同一反應管內檢測多達50個核苷酸序列的拷貝數變化的方法。其具有特異性高、精確度高、重復性好、操作簡便、高通量等優點。MLPA技術可檢測出若干人類基因拷貝數的變異, 也可檢出已知點突變, 現已廣泛應用于存在基因缺失/重復突變、點突變的人類遺傳疾病的分子診斷, 如DMD/BMD、SMA、迪格奧爾格綜合征 (Di Georges syndrome) 等[8,9,10]。但MLPA對DNA濃度和純度要求高, 只能檢測基因或染色體數目的異常或已知點突變, 不能篩查未知點突變和平衡易位等, 另外MLPA技術的開展必須要求毛細管電泳設備。

          2.4 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術 (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)

          PCR-RFLP技術主要是針對PCR產物, 選擇特異的限制性內切酶進行酶切, 然后采用瓊脂糖電泳或聚丙烯凝膠電泳技術分離酶切片段, 目前臨床上主要用于具有突變熱點的基因檢測, 如SMA致病基因SMN基因的突變熱點Exon7缺失的檢測, FGFR3基因突變熱點cll38A>G位點的突變檢測等[11,12]。

          2.5 三引物PCR (triplet repeat primed PCR, TP-PCR)

          TP-PCR是采用一對引物和一條隨機結合的中間引物共3條引物進行PCR擴增的方法。此方法常用于動態突變遺傳病三核苷酸拷貝數變異的檢測, TP-PCR產物經毛細管電泳檢測形成范圍超過一定堿基數 (例如50 CTG×3) 的連續毛刺狀峰, 提示為患者。TP-PCR反應需要設計合理的中間引物, 要注意保證引物的濃度比例以及采用高特異的DNA聚合酶。目前臨床上使用較多的是脆性X染色體綜合征致病基因FMR1基因動態突變及強直性肌營養不良致病基因DM1基因的動態突變的檢測[13,14]。

          2.6 巢式PCR擴增技術

          LR-PCR是指擴增長度大于5 kb片段的PCR。LR-PCR反應需要選用高保真的DNA聚合酶, 這類酶除了具有高保真性, 同時具有優良的延伸性和高效的擴增效率。巢式PCR是以前次PCR產物為模板, 設計引物擴增多個或單個小的PCR片斷。對于存在高度同源序列的基因 (如PKD1、GBA、SMN1、CYP21A2基因) 的序列突變分析, 為了避免同源序列 (假基因) 的干擾, 通常利用基于LR-PCR的巢式PCR擴增技術。首先, 比對目標基因與同源序列, 尋找差異性位點, 設計長片段特異性引物, 確保LR-PCR擴增的特異性;其次, 以LR-PCR產物為模板, 以內部巢氏PCR引物, 采用常規PCR擴增目標基因特定目標區域。

          2.7 倒位PCR技術 (inversion-PCR, I-PCR)

          I-PCR是針對血友病A (hemophilia A, HA) 的一種檢測技術, HA是一種X連鎖隱性遺傳病, 由F8基因突變導致。F8基因的Inv22和Inv1分別占重型HA的40%~50%和2%~3%[15], 對Inv22和Inv1的檢測手段包括Southern blot、長片段PCR (long distance PCR, LD-PCR) 和I-PCR。目前對intron 22重組檢測的常用方法主要為LD-PCR和I-PCR 2種。LD-PCR片段大于10 kb, 不能確定intron 22重組的亞型, 并且擴增片段GC含量較高, 對DNA質量和試劑要求較高, 成功率較低。I-PCR包括酶切、環化和引物擴增等3個步驟。I-PCR有產物片段大小特定、片段比較小、GC含量較低等優點, 因此能快速檢測Inv22-I、Dup22和Del22的患者、攜帶者和正常人。

          2.8 DNA芯片技術

          DNA芯片原理是在固定支持物上合成大量寡核苷酸作為DNA探針與待測的核酸片段雜交, 對雜交后的信息進行分析, 從而得到靶片段的基因序列、表達情況等信息。該技術檢測信息高通量, 自動化程度高, 一次可檢測眾多突變位點, 可用于疾病臨床早期診斷和批量篩選、基因表達譜測定、多態性分析等, 但由于芯片技術只能檢測已知突變位點, 隨著高通量測序技術的快速進展, DNA芯片在單基因遺傳病基因診斷中的應用受到了一定限制, 在國內DNA芯片的單基因病診斷應用主要為耳聾DNA芯片的檢測。

          3 以高通量測序為中心的單基因病分子診斷策略

          3.1 Panel靶向測序

          以Panel為基礎的靶向高通量測序可分為單個基因靶向捕獲高通量測序和多個基因靶向捕獲高通量測序。單個基因靶向Panel高通量測序的設計理論基礎是針對片段較長的基因, 如DMD基因、結節性硬化 (tuberous sclerosis complex, TSC) TSC1/2基因等的檢測采用特異基因Panel檢測效率遠優于Sanger測序, 另外一種多基因靶向捕獲Panel高通量測序是針對于遺傳異質性較強的疾病, 如癲癇、痙攣性截癱、遺傳性肌病、非綜合征型遺傳性耳聾等疾病, 對于給定樣本中的多個致病基因同時進行測序分析, 具有快速高效的特點, 但也存在一定局限性, 如隨著新的致病基因的不斷發現, 需要對多個基因靶向捕獲高通量測序panel進行不斷的更新, 但更新速度一般落后于新致病基因被發現的速度, 使得panel存在一定的滯后性。

          3.2 全外顯子組測序 (whole exome sequencing, WES)

          WES就是利用雜交捕獲技術獲取、富集基因組中所有具有蛋白編碼功能的外顯子區域DNA序列, 并對后者進行高通量測序的分析方法。人類的全基因組中有多達180 000個外顯子, 占整個基因組的1%左右[16], 通過高通量測序技術進行外顯子組測序, 是發現或鑒定引起疾病的遺傳變異的有效途徑。

          2009年, Ng等[16]在世界上首次證實外顯子組測序在確定罕見致病基因方面具有可行性和應用價值, 并于2010年首次成功地利用WES技術鑒定了米勒綜合征 (Miller syndrome) 的致病基因DHODH[17]。全外顯子組測序技術所需樣本數量少、通量高、耗費低, 大大推進了人類單基因遺傳病的分子診斷。

          外顯子組測序能夠更快地確定致病基因及突變位點[18], 有助于加速篩選發現單基因疾病、癌癥等復雜疾病的致病基因和易感基因等。但是外顯子組測序只能捕獲集中于外顯子區域的測序, 不能獲得完整的基因組信息且不適用于DNA結構變異和高度同源區變異體的檢測。

          3.3 全基因組測序 (whole genome sequencing, WGS)

          WGS是對已知標準基因組序列的個體進行全基因組的重測序。WES (外顯子組測序) 對于外顯子以外的區域不能有效地進行基因檢測, 通過WGS可進行全基因組檢測[18,19,20]。因為人類基因組過于龐大, 一次單端全基因組測序很難達到所需要的測序深度, 需要重復測序或雙端測序。因此, WGS成本昂貴且由于不能達到足夠的測序深度, 結果準確性會降低, 目前難以大規模應用于臨床。

          3.4 高通量測序用于單基因遺傳病的局限性

          雖然高通量測序有高通量和相對低成本的特點, 但對于單基因病基因診斷仍有其局限性, 首先是高通量測序的結果必須經過Sanger測序驗證, 通常高通量測序的結果不能直接用于診斷;其次高通量測序不能解決一些特殊的單基因病基因突變的檢測, 包括基因的倒位突變, 如血友病A基因有長片段倒位存在, 如SMA、腎上腺皮質發育不良、成人型多囊腎等存在假基因的疾病的基因診斷, 通過高通量測序往往不能得到滿意結果;再次, 由于受種族差異、數據庫及基因突變功能驗證等的影響, 大量的高通量測序結果不能得到很好的解讀, 也制約了高通量測序在單基因遺傳病分子診斷中的應用。

          4 以高通量測序為基礎的無創產前分子診斷 (non-invasive prenatal diagnosis, NIPD)

          4.1 胎兒游離核酸無創單基因病產前診斷

          利用無創產前檢測診斷胎兒單基因病的基本原理是在母體血漿總游離DNA (cell-free DNA, cf DNA) 中通過檢測出胎兒是否攜帶來自父母的致病基因或致病基因突變。對于常染色體顯性遺傳病, 通過檢測孕婦本人的血漿游離DNA是否攜帶致病位點 (父源突變、新發突變) 來判斷胎兒是否發病, 目前應用最多的是檢測軟骨發育不全 (achondroplasia) [21]。對于常染色體隱性遺傳病, 若父母同時攜帶不同的雜合突變 (先證者為復合雜合突變) , 如果在孕婦外周血中檢測到父源突變, 那么胎兒有50%的發病風險, 應進一步行侵入性產前診斷明確胎兒是否患病;如未檢出父源突變, 那么胎兒最多為攜帶者, 孕婦無需接受侵入性產前診斷, 避免了50%的孕產婦進行有創性產前診斷, 從而減少了不良妊娠結局的發生[22]。若父母攜帶相同致病雜合突變, 則需要通過大規模平行測序或數字PCR技術等精確定量胎兒游離DNA (cell-free fetal DNA, cff DNA) 濃度, 以此來分辨出突變來自父源或母源[23]。目前利用無創產前檢測可能診斷的單基因病包括軟骨發育不全、先天性腎上腺皮質增生 (congenital adrenalhyperplasia, CAH) 、DMD、楓糖尿病 (maple syrup urine disease) 、β地中海貧血 (β-mediterranean anemia) 和SMA等[21,24,25,26,27,28]。目前最新的進展是通過無創產前DNA檢測解決新發突變 (de novo mutation) , 未來可以通過NIPD進行胎兒的群體篩查, 包括遺傳性 (inheredited) 的突變和新發突變都可以通過該方法進行產前篩查。

          4.2 循環胎兒細胞無創單基因病產前診斷

          在孕早期的母血中存在微量的胎兒有核紅細胞 (nucleated red blood cell, NRBC) , 因其單核、含有完整胎兒遺傳信息且細胞周期短, 更適合全基因組分析, 被認為是實施NIPD較理想的靶點。但母血中的胎兒細胞非常少, 限制了其應用的發展。目前臨床上研究多針對改進細胞的分離方法, 有研究成功利用基于紅細胞微流控技術的富集和負向富集的兩級富集法分離出循環胎兒細胞并完成性別鑒定[29]。循環胎兒細胞在無創產前檢測領域具有巨大的潛能, 相信隨著技術進一步的發展, 利用循環胎兒細胞進行單基因病的NIPD或將成為新的研究熱點。

          4.3 子宮頸滋養層細胞無創單基因病產前診斷

          孕婦宮頸粘液中也存在胎兒脫落的絨毛細胞, 且數量不受胎齡、孕婦體重以及孕婦年齡的影響[30], 該發現為無創單基因病診斷提供了新的思路。有研究成功利用從宮頸脫落細胞中分離的胎兒細胞診斷地中海貧血和/或Hb S突變[31]。該技術有著良好的應用前景, 但標本母體細胞污染的問題可造成較高的假陽性率, 是目前面臨的主要挑戰。

          5 小結與展望

          分子診斷已經深入到單基因遺傳病診斷、產前診斷、新生兒篩查中。以PCR、Southern雜交為主的一些經典分子診斷技術將會保留。但越來越先進和精確的分子診斷技術將會不斷建立和發展, 特別是隨著高通量測序的快速發展, 以高通量測序, 包括第三代測序為基礎的單基因遺傳病的分子診斷方法將得到更廣泛的應用。除此之外, 越來越先進的分子診斷技術的建立和發展也對相關研究人員和臨床醫師的使用、解讀和咨詢提出了更高的要求。

          參考文獻
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          范文一: 遺傳病論文(獨家整理6篇)
          范文二: 胚胎干細胞構建遺傳疾病模型的意義探討
          范文三: 單基因遺傳病分子診斷技術的發展研究
          范文四: 探討男性染色體結構與數目異常
          范文五: 探討基因工程治療遺傳病的發展前景

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