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        不同細胞信號通路中PP2C家族各亞型的功能
        發布時間:2018-10-12
        摘要
          Abstract:The protein phosphatase 2C family (PP2C ) , belonging the protein phosphatases, is a kind of importantly specific serine/threonine dephosphatase.Recent studies show that PP2C control a lot of critical cellular functions:proliferation, cell cycle arrest, senescence and programmed cell death, apoptosis and autophagy, showing potentially biological role in regulating immune response, aging, neurogenesis and tumorigenesis.Several dominant cellular signaling pathways controlled by PP2C gene subtypes were reviewed in this paper, such as mitogen-activated protein kinase (MAPK) , phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) -AKT, transforming growth factorβ (TGF-β) /Smads, transcription factor nuclear factor-κB (NF-κB) and DNA-damage response pathways, which offered new ways to clarify the molecular basis and regular mechanisms for those physiological and pathological processes.

          Keyword:PP2C protein phosphatases; cell signaling pathways; MAPK; PI3K-AKT; TGF-β/Smads; NF-κB; DNA damage response;

          PP2C蛋白磷酸酶, 又稱金屬依賴性蛋白磷酸酶 (metal-dependent protein phophatases, PPMs) , 可以對磷酸化的絲/蘇氨酸殘基特異性脫磷酸。該類蛋白磷酸酶對廣譜磷酸酶抑制劑岡田酸不敏感, 其脫磷酸催化活性需依賴2價陽離子Mg2+和Mn2+。有趣的是, 在Mg2+存在的條件下, PP2Cδ磷酸酶活性被抑制而非激活[1]。
        不同細胞信號通路中PP2C家族各亞型的功能

          目前已鑒定的16個PP2C基因分別是PP2Cα, PP2Cβ, PP2Cγ, PP2Cδ/Wip1[2], PP2Cε, PP2Cη, PP2Cζ, PP2Cκ, CaMKP, CaMKP-N, PP2Cδ/IL-KAP, PHLPP, NERRP-2C, TA-PP2C, PDP1, PDP2[3]。不同的PP2C亞型在調節細胞應激、細胞周期、凋亡、蛋白質泛素化降解、新陳代謝、RNA剪接、線粒體功能等過程中發揮關鍵性作用[4-6]。在本文中, 筆者簡要概述不同細胞信號通路 (MAPK, PI3K-AKT, TGF-β/Smads, NF-κB及DNA損傷應答相關通路等) 中PP2C家族各亞型的功能。

          1、MAPK信號通路

          在哺乳動物細胞內, MAPK級聯反應是細胞內核心的信號通路。該通路的活化是由一系列磷酸化過程介導的, 當然, MAPKKK和MAPKK的活性也可通過脫磷酸被抑制。

          PP2Cα和PP2Cβ通過對MAPKKs脫磷酸抑制JNK和P38信號的傳導, 參與調節應激活化的MAPK信號通路[7]。在生理性和外界應激條件 (紫外輻射、熱休克及創傷) 下, PP2Cα可以對JNK的上游調節子MKK4和MKK7脫磷酸。在哺乳動物細胞中, PP2Cα或PP2Cβ過表達后可以通過對MKK3b、MKK6b、MKK4和MKK7脫磷酸, 抑制JNK和p38信號通路[8]。但是, PP2Cα和PP2Cβ并不影響MKK1及其下游ERK的磷酸化和活性。

          此外, PP2C家族成員也可通過對MAPKKKs脫磷酸調節MAPK信號通路。TGF-β激活的激酶Ⅰ (TAK1) 和凋亡信號調節激酶1 (ASK1) 均位于JNK和P38信號通路的上游。研究表明, PP2Cβ1過表達抑制了TAK1介導的MKK 4-c-Jun氨基末端激酶和MKK 6-p38信號通路。免疫共沉淀提示, PP2Cβ-1可以與TAK1的核心區域發生相互作用。PP2Cβ-1轉染293T細胞阻斷了IL-1誘導的AP-1活化, 而PP2Cβ-1磷酸酶負性突變體PP2Cβ-1 (R/G) 過表達增強了IL-1誘導的AP-1報告基因的活化。

          綜上, PP2Cα、PP2Cβ和PP2Cε均可通過直接或間接的方式與MAPK級聯反應中的某些組分發生作用, 調控MAPK信號通路, 參與細胞生存或凋亡等相關信號通路的調節。

          2、PI3K-AKT信號通路

          細胞內AKT磷酸化是PI3K/PDK-1介導的磷酸化和Ser/Thr蛋白磷酸酶介導的脫磷酸維持動態平衡的結果。研究表明, PI3K-AKT通路可被脂磷酸酶和蛋白磷酸酶阻斷, 磷酸化和脫磷酸化間平衡失調可導致疾病的發生。據報道, 在原位前列腺癌和遷移性前列腺癌中, PI3K通路調控異常比例分別為42%和100%[9]。

          腫瘤抑制因子PTEN是一個脂磷酸酶, 可通過對PI (3, 4, 5) P3脫磷酸, 從而移除激活信號, 間接終止AKT的磷酸化和活化[10]。而AKT被直接脫磷酸導致失活的機制, 直到近來PP2C磷酸酶亞型中的PHLPP被發現才明朗起來[11]。

          研究發現, PHLPP可以對AKT脫磷酸, 終止AKT信號通路, 誘導凋亡并抑制腫瘤生長。在幾株結腸癌和膠質母細胞瘤腫瘤細胞株中, PHLPP表達水平顯著下調, AKT磷酸化水平上調。由此證明, PHLPP的表達與腫瘤的發生密切相關。此外, PHLPP磷酸酶活性對AKT亞型具有特異性[12]。PHLPP1僅能對AKT2和AKT3脫磷酸, 而PHLPP2僅能對AKT1和AKT3脫磷酸。敲減實驗證明, PHLPP1通過對AKT2脫磷酸, 特異性調節HDM2和GSK3α的活性;PHLPP2通過對AKT3脫磷酸, 特異性調節p27。最新的研究表明, PHLPP已成為骨關節炎、膽囊癌等潛在的新的治療靶點[13,14]。

          研究發現, PHLPP過表達可誘導乳腺癌MT2細胞株和前列腺癌Panc1細胞株發生凋亡。在不同類型細胞中, Mst1是細胞凋亡的誘導因子。AKT磷酸化Mst1T387, 可抑制其活化[15]。PHLPP對Mst1抑制性磷酸化位點T387脫磷酸, 可活化Mst1并激活下游p38和JNK信號通路, 進而誘導癌細胞凋亡[16]。因而, PHLPP-AKT-Mst1三者共同調控癌細胞的增殖和凋亡, 為腫瘤治療提供了新的思路。

          3、NF-κB通路

          除主要參與介導免疫和炎癥反應外, NF-κB通路也是癌細胞活化的主要通路之一, 可促進大多數類型癌細胞的轉化、增殖、遷移和化療抵抗性[17,18]。研究表明, 與NF-κB結合的κB抑制蛋白 (IκB) 被磷酸化降解后, 可激活NF-κB信號通路。IκB可被活化的IκB激酶IKK磷酸化。IKK復合體包含2個催化亞基IKKα/IKKβ以及1個調節亞基IKKγ/NEMO, 其活性也是由磷酸化激活[19]。Sun等采用功能基因組學的方法篩選并證明, PP2Cα和PP2Cβ可對IKKβ激酶環內保守的Ser177和Ser181殘基脫磷酸, 從而降低其激酶活性, 繼而降低NF-κB轉錄活性[20]。

          近來, NF-κB信號通路在腫瘤研究中獲得了充分的關注, 尤其是因為越來越多的證據表明炎癥通過NF-κB通路與腫瘤的啟動、發生和發展密切相關。PHLPP2可以抑制腫瘤生長和侵襲, 但是在神經膠質瘤和結直腸癌細胞中表達呈進展性下調。PHLPP2也可作為NF-κB信號通路的主要負性調節子。在生長因子刺激下, Bcl10-MALT1泛素連接酶復合體形成, 導致NEMO/IKKγ發生泛素化, 暴露IKKβ磷酸化位點。PHLPP2與MALT1競爭性結合Bcl10, 可阻止復合物的形成。在癌細胞中, 由于PHLPP2的下調, Bcl10-MALT1復合體形成增加, IKKβ磷酸化水平升高, 增強NF-κB依賴的多個靶基因轉錄[21]。

          NF-κB的失調也被證實是前列腺癌遠距離遷移的主要驅動因素[22], 是前列腺癌患者的最主要死因。研究證實, 細胞核內NF-κB轉錄活性需要RelA蛋白Ser536和Ser276殘基發生磷酸化才能被完全激活[23]。Lu等發現PPM1A/PP2Cα可對RelA脫磷酸, 具有腫瘤抑制活性[24]。PPM1A可直接對RelA蛋白Ser536和Ser276殘基脫磷酸, 選擇性抑制NF-κB轉錄活性, 導致腫瘤遷移相關細胞因子如單核細胞趨化性蛋白-1/趨化因子 (C-C模體) 配體2以及IL-6表達下調。PPM1A敲除后可增強NF-κB依賴的細胞侵襲能力, 而過表達則會抑制細胞侵襲。

          近來, 研究者們用siRNA的方法在基因組范圍內篩選NF-κB信號調節子時發現, Wip1/PPM1δ被鑒定為NF-κB信號通路的負性調節因子[25]。Wip1過表達呈劑量依賴性下調NF-κB活性, 但是Wip1敲減可增強NF-κB功能。Wip1可以直接對NF-κB p65亞基Ser536位脫磷酸, 阻止p65與轉錄共激活子p300的結合。體內實驗證明, Wip1缺失可增強小鼠炎癥反應。但是Julie等卻發現NF-κB是Wip1磷酸酶的正向轉錄調節因子[26]。Ppm1δ基因編碼Wip1蛋白磷酸酶。TNF-α刺激可增強NF-κB的p65亞基結合到含有κB位點的Ppm1δ基因啟動子區域。因而NF-κB激活后可增加Wip1在mRNA和蛋白水平的表達。

          4、TGFβ/Smads通路

          TGFβ超家族成員參與大量的細胞反應, 如細胞增殖、分化、細胞外基質重塑、胚胎發育等, 在癌癥、纖維化和自身免疫性疾病等的發病中起關鍵作用。TGFβ結合到細胞膜TGFβⅡ型受體 (TβRⅡ) 上, 進而磷酸化激活TGF-βⅠ型受體 (TβRⅠ) 。然后, TβRⅠ磷酸化受體活化的Smads (R-Smads) 、Smad2和Smad3, 釋放的R-Smads與Smad4結合進入細胞核, 與不同類型的轉錄因子相互作用, 從而調控基因的表達。R-Smads脫磷酸是介導TGFβ信號終止的一種調節機制, PPM1A/PP2Cα是Smad2/3特異性磷酸酶。

          Feng等采用功能基因組學的方法, 在人類基因組數據庫中搜索并鑒定了PPM1A/PP2Cα可對R-Smads脫磷酸, 抑制TGF-β信號通路[27]。他們發現在構建的39種磷酸酶表達載體中, 只有PP2Cα可以明顯降低組成型活化的大鼠TβRⅠ誘導的Smad2/3的磷酸化水平。PP2Cα過表達使磷酸化的Smad2和Smad3脫磷酸, 且與Smad4分離, 促進了Smad2/3的核外轉移。PP2Cα敲減后可增強細胞對TGFβ刺激的敏感性, 導致細胞增殖和轉錄活性增強。Dai等進一步發現, PPM1A可通過對細胞核內RanBP3Ser58脫磷酸, 促進其將Smad2/3向核外轉移, 終止TGFβ信號[28]。

          此外, 研究表明肝纖維化與TGFβ信號通路的過度活化密切相關。Wang等[29]經體內和體外實驗證實, PP2Cα過表達可對TGFβ誘導的肝星狀細胞中磷酸化的Smad3和p38特異性脫磷酸, 終止TGF-β信號通路;誘導細胞周期阻滯在G1期, 抑制細胞增殖。篩選獲得的天然產物NPLC0393作為PP2Cα特異性小分子激活劑, 可通過增強PP2Cα的磷酸酶活性, 有效緩解肝纖維化, 因而有望成為治療肝纖維化的潛在先導化合物。

          近年來, 大量研究表明TGF-β可在某些上皮細胞中介導上皮細胞間質轉型 (epithelial-mesenchymal transition, EMT) 。EMT不僅在胚胎發育中發揮關鍵作用, 而且與某些疾病的發病有緊密聯系, 如肝腎纖維化和肝細胞癌。TGFβ信號通路被認為通過增加腫瘤細胞的運動性、侵襲和遷移, 誘導EMT的發生, 參與了腫瘤的發生和發展[30]。Geng等發現PPM1A表達水平下調與膀胱癌的遷移惡化密切相關[31]。功能基因組學證明, PPM1A被阻斷可促進泌尿性膀胱癌細胞體外能動性及體內遷移能力, 這些效應均依賴TGF-β/Smads信號通路。細胞內PPM1A缺失可增加TGF-β誘導的p-Smad2/3水平。

          綜上所述, PP2C亞型中的PPM1A蛋白磷酸酶通過調控Smad2/3脫磷酸終止TGFβ信號, 緩解了肝纖維化, 阻止了癌細胞的遷移和侵襲。由此提示我們, PPM1A可能是一個抑癌基因。

          5、DNA損傷應答

          細胞內的DNA分子因物理、化學等多種因素的作用可使堿基組成或排列發生變化, 若這些改變都表現為基因突變, 則機體難以生存。因而, 在長期進化過程中, 細胞或機體形成了多種DNA損傷修復應答信號通路, 保持了DNA分子的相對穩定性。在DNA損傷應答信號通路中, 關鍵性激酶ATM、ATR和DNA-PKcs被磷酸化激活, 進而磷酸化其底物如p53、Chk1、Chk2、MDM2等, 啟動DNA修復機制[32]。

          首先, DNA雙鏈斷裂后, ATM Ser1981發生自身磷酸化可被快速激活。PPM1δ通過抑制ATM Ser1981位點磷酸化, 調節DNA損傷后活化的ATM信號通路[33,34]。PPM1δ缺失的鼠胚成纖維細胞用電離輻射處理后, ATM Ser1981位點磷酸化水平升高, 提示ATM激酶活性增強。

          其次, Chk1和Chk2檢查點激酶在進化上是相當保守的, 并在DNA損傷應答中發揮關鍵作用。PP2Cδ可對Chk1Ser345脫磷酸, 降低紫外應激下Chk1激酶活性。內源性高表達PP2Cδ的幾株乳腺癌細胞系在紫外誘導下Chk1Ser345磷酸化被抑制[35]。Leteurtre等證明, 在電離輻射誘導的DNA損傷應答中, PP2Cδ可與Chk2結合, 并對Thr68脫磷酸, 導致Chk2激酶活性降低, 抑制DNA損傷中的Chk2信號[36]。

          第三, 腫瘤抑制子p53是DNA損傷應答的核心節點。在電離輻射和紫外輻射下, ATM和ATR可磷酸化p53Ser15, 促進p53的凋亡活性和穩定性, 阻斷了p53和MDM2結合[37]。p53與MDM2的結合導致其發生泛素化降解。由此提示我們, PP2Cδ在調節p53活性及穩定性中發揮了關鍵作用。

          第四, 紫外輻射可導致p38MAPK Thr180和Tyr182兩個位點的磷酸化。活化后的p38可對p53Ser15、Ser33、Ser46和Ser392位點磷酸化, 增加p53轉錄活性, 誘導凋亡。PP2Cδ可對p38MAPK Thr180選擇性脫磷酸, 從而抑制p38對p53Ser33和Ser46的磷酸化, 降低p53的轉錄活性, 阻止p53介導的凋亡[38]。

          第五, 在哺乳動物細胞中, DNA的一個共同病變是由胞嘧啶脫氨基或復制過程中dUMP錯插產生尿嘧啶。UNG2和尿嘧啶DNA糖基化酶, 是哺乳動物核DNA催化尿嘧啶移除的主要酶。紫外輻射可導致UNG2 Thr6和Thr126發生磷酸化。PP2Cδ可以使UNG2Thr6脫磷酸, 降低UNG2活性, 從而在DNA修復完成后抑制該酶的活性。

          6、展望

          PP2C蛋白磷酸酶家族各亞型不僅參與調控正常細胞的生長、增殖、分化、凋亡等生理過程, 而且是腫瘤細胞轉化、增殖、遷移和侵襲的重要調控因子。因而提示我們, 這些蛋白磷酸酶的活化或抑制有可能成為臨床不同疾病治療的潛在作用靶點。目前已發現部分小分子抑制劑可以特異性激活或抑制PP2C某些亞型。通過闡明該家族各亞型是如何在細胞水平和分子水平調控下游靶基因和蛋白發揮作用的, 筆者期待在未來的數年中能夠發現更多的化學小分子藥物可以特異性作用于PP2C蛋白磷酸酶, 以擴展其在臨床治療中的應用。

          參考文獻
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