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        血管內皮細胞miRNA對血管生成過程的影響
        發布時間:2017-02-27

        摘要

         

          血管新生( angiogenesis) 是指在原有血管網基礎上,由血管內皮細胞出芽形成新的微血管的過程[1],而血管發生( vasculogenesis) 則是指由中胚層的內皮前體細胞( endothelial precursor cells,EPCs)在原位分化形成新血管的過程[2]. 血管發生被認為主要出現在胚胎形成過程中,而血管新生則在發育及多種生理、病理過程中都存在,包括腫瘤的發生、發展等。 在血管的形成、發育和血管相關疾病發生過程中,作為管脈結構內部屏障的血管內皮細胞起著關鍵的作用。 事實上,血管新生過程就是內皮細胞經過一系列的變化,包括細胞增殖、遷移、粘附及形成管腔結構等過程而最終形成血管,并組成血管網絡。
          
          該過程受到很多血管生成相關因子的調控,包括促血管生成因子和血管生成抑制因子。 在成體組織中,大多數血管保持靜止,引導血流; 而一旦血管生成過程失去正常的調控,促血管生成因子活性過高時,可通過激活 MAPK、PI3K 等通路而促進血管內皮細胞的增殖、遷移等[3],最終會導致很多疾病的發生。
          
          血管生成素( angiogenin,ANG) 是一個 14 kD 的堿性核糖核酸酶; 1985 年基于其促血管生成活性而從結腸腺癌細胞 HT29 培養液中被分離純化[4],且已發現 ANG 在多種腫瘤中表達上調[5]. 雖然 ANG的異常表達與多種腫瘤的發生、發展及惡化相關,具有促血管生成和腫瘤細胞增殖的雙重活性,但是目前對 ANG 作用機制的了解仍非常有限。 研究發現,ANG 不僅 可 與 血管 內 皮 細胞 表 面 的 肌 動 蛋白 結合[6],激活細胞外周的蛋白酶,降解基底膜和胞外基質,促進細胞的遷移,而且可激活靶細胞的 Erk1/2、PKB / Akt 和 / 或 SAPK / JNK 信號轉導通路而活化細胞[7-9]. 同時,ANG 的促血管生成活性依賴于其核轉位能力。 外源 ANG 可快速進入血管內皮細胞的細胞核,特異性地定位于核仁區[10]. 目前認為,ANG通過作用于血管內皮細胞,能誘導細胞遷移[11]、增殖[12]、管腔形成[13]等細胞學事件,而這些事件正是血管生成的基本生物學過程。microRNA( miRNA) 是一類內源性的長約 22 nt的單鏈小分子 RNA[14],通過與靶基因 mRNA 結合,在轉錄后水平對基因表達進行廣泛調節,從而調控各種生理、病理過程,包括血管生成。
          
          本研究首先利用生物信息學方法預測了靶向ANG-3'UTR 的候選 miRNA,然后驗證了它們之間的靶向關系,最后在 ANG 誘導血管生成的主要靶細胞,即血管內皮細胞中檢測了這些 miRNA 對血管生成過程的影響。
          
          1 材料與方法
          
          1. 1 材料
          
          人臍靜脈血管內皮細胞( HUVEC) 按前所述方法[15]分離自健康新生兒臍帶,COS-7 細胞購自上海中科院細胞庫。 Human Endothelial-SFM( Invitrogen,GB11111-044 ) 、M199 ( Hyclone,SH30253. 01B ) 、DMEM ( Invitrogen, GB12800-017 ) 、 胎 牛 血 清( Invitrogen,GB10099-141) 、內皮細胞生長補加培養基 ( ECGs, Millipore,02-102 ) 、青 霉 素/鏈 霉 素( Invitrogen,15140122 ) 、Typsin EDTA ( Invitrogen,GB25200-072 ) 、OPTI-MEM ( Invitrogen,31985 ) 、Lipofectamine2000 ( Invitrogen,GB11668-019 ) 、TrizolReagent( Invitrogen,GB15596-018 ) 、NaAc ( 3 mol / L,pH5. 2) ( Amresco SE521) 、Glycogen( BBI,GB0301) 、MMLV 逆轉錄酶( Invitrogen,SKU#28025-013) 、dNTPMix( Sangon,D0056 ) 、隨 機 引 物 ( Sangon,B0043 ) 、SYBR Premix EX Taq ( TaKaRa RR420A ) 、TaqManUniv PCR MM,no UNG ( ABI,4364343 ) 、TaqmanmicroRNA RT Kit ( ABI,4366597 ) 、β-actin 抗 體( Santa Cruz,sc-1615) 、GAPDH 抗體( Cell Signaling,2118) . siRNA 均購自上海吉瑪制藥技術有限公司,引物購自上海生工。 ANG 的兔源多克隆抗體為本實驗室自備[16].
          
          1. 2 細胞培養與轉染
          
          細胞培養: 每 200 mL HUVEC 培養液含 HE-SFM 72 mL、M199 105 mL、FBS 10% 、ECGs 15 μg /mL 和 Penicillin-Streptomycin 1 × . Cos-7 培養液為含10% FBS 的 DMEM. 細胞置于 37℃ 、5% CO2培養箱中培養,生長至 80%融合狀態時傳代。 細胞轉染:接種細胞,生長至 70% ~ 80% 融合狀態,換成新鮮的無血清培養液,按照 Lipofectamine 2000 說明書轉染 DNA、siRNA 或 miRNA; 轉染后4 ~6 h 后,換成含血清的培養液繼續培養 24 ~48 h.
          
          1. 3 RNA 提取
          
          用 Trizol 裂解細胞( 1 mL/10 cm2) ,室溫靜置5 min,收集至離心管中; 加入 0. 2 倍體積的三氯甲烷,振蕩混勻,室溫靜置 5 min; 12 000 g,4℃,離心15 min; 將上層液體轉移至新離心管內,加入 1 /10 體積( 上清體積) 的 NaAc( 3 mol/L,pH 5. 2) 和 1 μLGlycogen,然后與 0. 5 倍體積( Trizol 體積) 的異丙醇混勻,-20℃靜置1 h;12 000 g,4℃,離心 10 min; 棄上清,加入 1 mL 75% 乙醇,重懸沉淀; 7 500 g,離心 5min; 棄上清,晾干沉淀; 加 30 ~ 50 μL DEPC 水溶解沉淀; 用 NanoDrop 檢測 RNA 濃度,分裝后 -80℃保存。
          
          1. 4 RT-PCR
          
          反轉錄: 反應體系總體積為 10 μL,含 DEPC 水1. 5 μL、5 × First Strand Buffer 2 μL、0. 1mol / L DTT 1μL、dNTP ( 10 mmol/L) 0. 5 μL、Random Primer( 100 μmol /L) 0. 5 μL、M-MLV RT ( 200 U/μL)0. 5μL、Total RNA ( 50 ng / μL) 4 μL; 按照程序 25℃10 min、37℃ 2 h、70℃ 15 min 進行反應,反轉錄產物-20℃保存。
          
          熒光定量 PCR: 反應體系總體積 10 μL,含 ddH2O 2. 3 μL、2 × SYBR 5 μL、50 × ROX Dye 0. 2 μL、Primer Mix ( 1 μmol / L each) 2 μL、cDNA 0. 5 μL; 反應程序為: 95℃,30 s; 95℃,5 s、60℃,30 s ( 40cycles) ; 95℃ ,15 s、55℃ ,15 s、95℃ ,15 s. 引物序列見 Table 1. 加樣,封板,離心,在 ABI 7900HT 定量PCR 儀上按照以上程序進行 qPCR.
          
          1. 5 質粒構建
          
          PCR 擴 增 ANG 全 長 cDNA,連 入 載 體pcDNA3. 1,構 建 質 粒 pcDNA3. 1-sigANG-3' UTR 用于真核過表達 ANG; PCR 擴增 ANG 的 3'UTR 基因,連入 psiCHECK-2 載 體,構 建 質 粒 psiCHECK-2-ANG3'UTR 用于雙熒光素酶報告基因檢測。 所有構建成功的質粒均經過 DNA 測序( 南京金思瑞公司)分析,序列正確的用于進一步的實驗。
          
          1. 6 免疫印跡
          
          用 RIPA 裂 解 液 裂 解 細 胞 提 取 蛋 白,并 用Branford 法進行蛋白定量; 取等量蛋白加入等體積 2× Loading Buffer,99℃ 加 熱 5 min; 用 15% SDS-PAGE 分離蛋白后,采用濕轉法將蛋白質轉印至 NC膜上; 用 3%BSA-TBST 封閉 2 h,ANG 一抗按照 1∶ 1000 稀釋于封閉液中 4℃ 孵育過夜,TBST 洗膜后用羊抗兔熒光二抗( 1∶ 10 000) 室溫孵育 40 min; 避光洗膜后熒光掃描檢測。
          
          1. 7 細胞增殖
          
          按一定密度接種細胞于培養皿,孵育過夜; 轉染miRNA 或 siRNA,培 養 24 h; 消 化 收 集 細胞,按 照2 000個 / 孔細胞密度接種于 96 孔細胞培養板中,并加入 10 ng/mL bFGF,分別在接種0、24、48、72 h 后,用 CCK-8 試劑盒檢測細胞數目,進行統計分析。
          
          1. 8 管腔形成
          
          Matrigel 置冰上,放在 4℃ 過夜融化; 將 Matrigel混勻,均勻鋪在 96 孔板底面,每孔 50 μL,避免氣泡,所有操作均在冰上進行; 完成后置培養板于37℃ 培養箱,30 ~ 60 min,使 Matrigel 凝固; 消化收集細胞,用無血清培養基 HE-SFM 洗細胞 3 次; 重懸于無血清培養基 HE-SFM 中,細胞計數; 調整細胞密度至 60 000 個/mL,每孔接種 100 μL; 置 37℃培養箱培養,6 h 后觀察,拍照; 圖片用 Image-Pro Plus 6. 0軟件分析,統計管腔長度。
          
          1. 9 統計學分析
          
          實驗數據均以平均值 ± 標準差( Mean ± SD)形式表示,每組實驗獨立重復 3 次。 數據處理采用Graph Prism 5 軟件進行。 兩組間數據比較采用的 t檢驗分析( t tests and nonparametric tests) ,多組比較用單因素方差分析,P <0. 05 則具有統計學意義。
          
          2 結果
          
          2. 1 靶向 ANG 的 miRNA 的預測
          
          根據文獻報道,選擇較為常用的數據庫對靶向 ANG-3'UTR( 3'untranslated region) 的 miRNA 進行預測,包括 TargetScan、miRNA. org 和 MicroCosm( 具體網址見 Table 2) . 通過預測,3 個數據庫分別給出 可 能 靶 向 ANG-3' UTR 的 miRNA,結 果 如Table 2 所示。
          
          經綜合分析,本論文選擇 8 個 miRNAs 進行下一步實驗驗證,包括 miR-1208、miR-182、miR-196b、miR-198、miR-296-5p、miR-409-3p、miR-570 和 miR-641( 以粗斜體標示在 Table 3 中) . 該 8 個 miRNA 與ANG-3'UTR 的結合位點見 Fig. 1A 所示。
          
          2. 2 候選 miRNAs 的驗證
          
          為驗證這些預測得到的 8 個 miRNA 是否真正靶向 ANG-3'UTR 而調控 ANG 的表達,本文利用化學合成的 miRNA mimic 分別檢測它們對 ANG 的蛋白水平和 mRNA 水平的影響,以及它們與 ANG-3'UTR序列的直接靶向關系。 結果顯示,在 HUVEC中分別轉染候選的 8 個 miRNA mimic 后,ANG 的蛋白表達水平受到不同程度的抑制( Fig. 1B) ,其中miR-296、miR-409-3p 和 miR-570 對 ANG 的 mRNA水平也有抑制作用( Fig. 1C) ; 在雙熒光素酶報告基因檢測系統中,miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和miR-641 可以下調連接有 ANG-3' UTR 的報告基因螢光蛋白的表達( Fig. 1D) ,說明 miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和 miR-641 可以 直 接靶向結合ANG-3'UTR而抑制 ANG 的表達。 因此,我們進一步對 miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和 miR-641 這 4個 miRNA 進行了血管生成相關的功能分析。
          
          2. 3 候選 miRNAs 對血管內皮細胞增殖的影響
          
          分離培養人臍靜脈血管內皮細胞,取其中第 3-8 代的細胞用于實驗。 按一定密度接種細胞于培養皿中,培養過夜; 轉染 miRNA mimic、siRNA 或對照小 RNA 后,繼續培養 24 h; 消化收集細胞,按照2000 細胞 / 孔密度接種于 96 孔細胞培養板中,并加入 10 ng/mL bFGF 培養。 分別在接種后的第 0、24、48 和 72 h,用 CCK-8 試劑盒檢測細胞數目,進行統計分析。 結果如 Fig. 2 所示,miR-296 和 miR-409-3p能顯著抑制 HUVEC 的細胞增殖,效果接近 siANG( siANG 為針對 ANG 的 siRNA) ; miR-641 也可以抑制 HUVEC 的細胞增殖,而 miR-196b 則對 HUVEC的細胞增殖作用幾乎沒有影響。
          
          2. 4 候選 miRNAs 對血管內皮細胞管腔形成的影響
          
          同時,我們用 HUVEC 的管腔形成實驗檢測這 4個 miRNA 對血管生成過程的影響。 HUVEC 細胞在轉入了不同的 miRNA mimic \siRNA 或對照小 RNA后,以 80 000 細胞/mL 的密度接種于鋪有 Matrigel的培養板上,每孔接種 100 μL; 置 37℃培養箱培養,6 h 后觀察并拍照,圖片用 Image-Pro Plus 6. 0 軟件分析,統計管腔長度。 結果如 Fig. 3 所示,miR-196b,miR-296 和 miR-409-3p 能抑制 HUVEC 的管 腔 形成,而 miR-641 則對 HUVEC 管腔形成的抑制作用不明顯,其中針對 ANG 的 siRNA 對 HUVEC 的管腔形成抑制作用最明顯。
          
          3 討論
          
          通過本項研究,我們發現 miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和 miR-641 可以直接靶向 ANG 而發揮對血管生成的調控作用。 其中,miR-409-3p 通過下調 ANG 調控腫瘤血管生成及腫瘤轉移的研究結果已由本實驗室報道[16]. 我們的結果顯示,這些靶向ANG 的 miRNA 所表現的生物學功能是有差異的,例如 miR-196b 對 HUVEC 的細胞增殖沒有影響,但可以抑制 HUVEC 的管腔形成; miR-296 和 miR-409-3p 對 HUVEC 的細胞增殖和管腔形成均有抑制作用; 而 miR-641 則只對 HUVEC 的細胞增殖有抑制作用,提示不同的 miRNA 在調控 ANG 的同時也調控了其它基因,從而影響不同的生物學過程。 因此,只有全面研究 miRNA 對 ANG 的調控,才有可能全面闡明 ANG 的生物學功能及其作用機制。
          
          miRNA 是通過與靶基因 mRNA 的堿基互補配對來引導其對基因的轉錄后調控的[17],因 此,miRNA 的“seed”序列被認為是指導沉默復合體靶向靶基因 mRNA 的關鍵序列。 一般地,miRNA 的“seed”序列與靶基因的 mRNA 形成 6 ~8 個堿基的完全互補配對結構。 但是“seed”與靶基因 mRNA 的結合并不一定能介導基因的抑制,該互補結合是miRNA 調控基因的重要條件但并不是充分條件,結合區域以外的序列及因素都可影響 miRNA 對靶基因的識別和調控。 同時,同一個 miRNA 不僅可以抑制靶基因 mRNA 的翻譯,也可以引導 mRNA 的降解[18]. 目前認為,mRNA 是否被降解不是由 miRNA本身決定,而是取決于 miRNA-mRNA 形成的雙鏈結構及靶基因 mRNA 的序列,包括其結合位點的數目、位置及間距、結合類型、錯配的位置以及與mRNA 結 合 的 不 同 miRNPs ( a novel class ofribonucleoproteins containing numerous microRNAs )等[19-20]. 我們的研究結果顯示,有些 miRNA( 如 miR-296、miR-409-3p 和 miR-570 ) 既 可 下 調 ANG 的mRNA 水平,也降低蛋白質表達水平; 而 miR-1208、miR-196b 和 miR-641 只下調蛋白質表達。
          
          需要指出的是,本研究只篩選了靶向 ANG-3'UTR 的 miRNA,沒有考慮那些結合在基因編碼區或5'UTR 的 miRNA.
          
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