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        近年來犬瘟熱病毒H蛋白變異及其受體探析
        發布時間:2016-06-06

        摘要

         

          犬瘟熱(Canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一種世界范圍內多種肉食動物多系統感染的病毒性傳染病。

          CDV自然感染宿主除食肉目所有8個科外,還擴展到偶蹄目豬科、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動物[1].CDV屬于副黏病毒科麻疹病毒屬的單股負鏈線性RNA病毒,同屬的病毒有麻疹病毒(Measles virus,MV)、牛瘟病毒(Renderpest virus,RPV)等,總編碼8種蛋白,主要有核衣殼蛋白(nu-cleocapsid protein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)、基質膜蛋白(matrix protein,M)、融合蛋白(fusionprotein,F)、附著或血凝蛋白(attachment protein orhemagglutinin protein H)、大蛋白(the large virusspecificied RNA directed RNA polymerase protein,L)6種。

          血凝蛋白(H)是CDV囊膜表面主要糖蛋白之一,CDV通過H蛋白吸附到細胞受體上來啟動病毒感染過程,因此H蛋白決定了CDV的宿主特異性和組織嗜性。其變異率在所有結構蛋白中最高(變異率由高到低依次為H、N、L、P、F、M),是宿主范圍擴大和新基因型出現的重要原因。基于H基因的變異性,CDV被分為9種與地域相關的基因型:

          America-Ⅰ、America-Ⅱ、Arctic、Asia-Ⅰ、Asia-Ⅱ、European wildlife、South Africa、Europe/SouthAmerica-Ⅰ、South America-Ⅱ。

          細胞表面受體是導致病毒的組織嗜性和感染宿主范圍的重要因素,CDV的跨種間傳播現象與其感染宿主的細胞受體表達有密切關系,至今已發現信號淋 巴 細 胞 激 活 因 子 (SLAM)和 黏 連 蛋 白4(PVRL-4/nectin-4)分別作為CDV的淋巴細胞和上皮細胞受體。本文就近年來犬瘟熱病毒H基因變異及其細胞受體的研究進展進行綜述。

          1 H基因及其蛋白功能

            1.1 H基因H蛋白基因由1 946個核苷酸組成,包含一個大的開放閱讀框,起始于21位點,終止于1 835位點,編碼一個含有605個氨基酸的蛋白質。在胞外域上,該蛋白質包含3個潛在的糖基化位點以及類似于其他副黏病毒的一個N末端跨膜疏水性錨定域。此外,CDV的H基因在核苷酸水平上與牛瘟病毒(RPV)具有52%的同一性,與麻疹病毒(MV)有36%的同一性,但推導的H蛋白序列與RPV和MV有36%的同一性,與MV和RPV的H蛋白相比,CDV的H蛋白氨基酸序列表現對所有結構因素具有保護性,此數據也表明,在H基因方面顯示出CDV與PRV和MV的等距進化[2].

          1.2 H蛋白功能

          H蛋白是構成囊膜纖突的主成分,能夠誘導機體產生中和抗體,是抗CDV免疫中很重要的抗原。野毒株和疫苗株H蛋白的潛在糖基化位點不同,糖基化位點不同可能影響病毒的抗原性[3].2000年,日本學者用抗CDV H蛋白的4種單克隆抗體(JD-5、JD-7、JD-11和d-7)分析日本CDV野毒株和疫苗株的抗原特性,發現H蛋白的抗原區與中和反應有關,其中d-7、JD-5和JD-11 3種單克隆抗體對所有CDV反應相似,但JD-7與疫苗株和較早的野毒株反應強烈,與新野毒株反應較弱,該方法可用于鑒別新毒株[4].

          CDV的包膜蛋白H對宿主細胞融合起主要作用。盡管CDV H蛋白的結構尚未完全解決,但基于麻疹病毒H蛋白的三維模型,發現幾個氨基酸殘基 (例 如D505、D507、Y529、D530、T531、R533、F552、Y553和P554)與細胞受體SLAM的相互作用非常重要[5].

          CDV H蛋白跟細胞受體的結合決定病毒的組織嗜性。有研究指出CDV適應犬足墊角質細胞(CFKs)與P/V/C、M、H蛋白上3個氨基酸改變有關,其中改變的P/V/C上的氨基酸有助于提高病毒滴度,改變H蛋白胞質端的氨基酸對細胞的致病性有影響[6].

          2 H蛋白的高變異率

          H蛋白是麻疹病毒屬病毒所有蛋白中變異率最高的蛋白。如2株CDV基因序列差異超過10%,就可以通過H蛋白抗原差異進行區別。因此單克隆抗體常用于區別野毒株和疫苗株[7].H蛋白變異主要反映在基因同源性差異、氨基酸位點突變、抗原表位漂移和糖基化位點變化等方面。許多流行病學調查資料顯示當前流行的CDV野毒株與疫苗株的H基因和氨基酸同源性差異大。

          郭玲等[8]對2002年-2010年 中 國 分 離 的14株CDV野毒株、2006年-2007年全球各地分離的12株CDV野毒株及從不同宿主分離的12株CDV野毒株和4株疫苗株的H基因進行遺傳變異分析發現,CDV野毒株與疫苗株間H蛋白基因的核苷酸相似 性 為86.2% ~92.1%,其 氨 基 酸 相 似 性 為89.1%~91.9%.有研究發現新宿主分離的CDV常在530位點和549位點上發生氨基酸替換,提示犬瘟熱在非犬宿主上傳播與這2個位點的變異有關[9].朱春生等[10]2011年-2013年從水貂、狐貍和貉源犬瘟熱陽性病料中分離出7株CDV野毒株,其中3株水貂和狐貍源CDV的H蛋白氨基酸在第549位點由Y突變成H,2株水貂源CDV H蛋白的受體結合區因第542位氨基酸I→N突變而增加了1個潛在N-糖基化位點,可能預示著CDV進化過程中H蛋白突變對非犬宿主(狐貍、水貂)的適應性增強。在免疫壓力作用下,CDV抗原表位可以發生漂移。王國超等[11]對石河子墾區患病犬的流行株和疫苗株H蛋白基因進行抗原表位預測,發現兩者抗原表位差異顯著;CDV H蛋白糖基化位點差異與其抗原性和毒力密切相關,野毒株的潛在糖基化位點為8個~9個,疫苗株中除Onderstepoort有4個糖基化位點外,Convac、CDV3和Lederle株均含有7個糖基化位點。有研究[12]在2013年對廣州地區100份患病犬進行CDV流行病學調查,發現309位的糖基化位點為CDV野毒株所特有,第584位的糖基化位點只在Asia-Ⅰ中發現。

          3 H基因變異導致CDV宿主范圍擴大

          H蛋白作為CDV細胞受體的結合位點,其變異情況對CDV的宿主范圍和趨性有極大影響。H蛋白變異性最大,被廣泛用于確定CDV變異程度來劃分基因型。根據近期全球CDV流行病學報道,在犬科及其他非犬科上均發現H蛋白變異大的CDV野毒 株。

          2014年,日 本 學 者 從 犬 中 分 離 到2株CDV,即Yanaka和Bunkyo-K毒株,Yanaka毒株無毒性且能誘導抗體反應,用作疫苗接種犬后,發現其能有效誘導CDV中和抗體,且不表現臨床癥狀,誘導的免 疫 保 護 反 應 與 強 毒 株 均 等,優 于 疫 苗 株;Bunkyo-K毒株能在犬大腦內增殖,使其毒力增強,產生典型的CDV臨床癥狀[13].同年,中國學者也從藏獒中分離到一株CDV新毒株(TM-CC),屬于Asia-Ⅰ型,對該毒株和Onderstepoort疫苗株H基因序列同源性分析發現僅有90.4%相似性,編碼的氨基酸相似性僅88.9%[14].很多 非 犬 科 類 的 食 肉 動 物 也 能 感 染CDV.

          2008年,德國巴伐利亞野生動物暴發CDV并引起腦炎癥狀,經氨基酸序列比對發現,從患病動物分離的6株CDV H基因第549位點發生了Y→H突變[15],結合以前相關研究推測H基因549位點的突變可能會導致CDV新宿主出現。

          2011年-2013年,中國東北,從已免疫的水貂、狐貍和貉中分離出16株CDV毒株,與同區域不同物種的CDV毒株進行H基因的序列分析,發現H蛋白編碼序列的542位點(異亮氨酸→天冬酰胺酸)和549位點(絡氨酸→組氨酸)發生氨基酸替換,并在542位點生成一個潛在的新糖基化位點[16].糖基化位點的增加會導致病毒抗原性變化,因此推測糖基化位點變化與CDV逃避疫苗產生的中和抗體有關。大熊貓也能感染CDV,2014年陜西珍稀野生動物4只大熊貓感染大熊貓源CDV死亡,遺傳進化分析顯示,該毒株屬于強毒株,基因型為Asia-I型,與20株具代表性的CDV全基因組序列同源性為91.5%~98.7%[17].

          除已發現的感染宿主外,近年流行病學調查陸續發現CDV新宿主。意大利學者發現亞平寧山脈狼暴發CDV大量致死,通過H基因序列的系統發育分析該毒株屬于Arctic型,這是歐洲野生動物首次報道感染CDV Arctic型[18].2013年首次發現CDV能感染不足400頭的珍稀動物東北虎,該虎源CDV H蛋白在538、548和570位點分別發生突變V→I、T→M和D→N,這3個位點均不是H蛋白和SLAM細胞受體結合域的關鍵氨基酸位點,從而導致CDV感染新興宿主東北虎[19].

          犬瘟熱病毒還擴大其宿主范圍至靈長類,2006年廣西某養殖場的獼猴暴發犬瘟熱,接著2008年北京動物中心的獼猴發現CDV,同年日本進口自中國的獼猴也感染CDV(CYN07-dV),通過體外試驗發現,CYN07-dV毒株對獼猴的SLAM和黏連蛋白4(nectin-4)受體的使用與犬源SLAM和nectin-4一樣有效[20].

          4 CDV受體細胞受體是病毒宿主特異性的一個決定因素。

          至今,已鑒定出2種CDV的細胞受體,即信號淋巴細胞激活因子(SLAM)和黏連蛋白4(PVRL-4/nec-tin-4)。SLAM僅在淋巴細胞上表達,如:激活的T淋巴細胞和B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞;PVRL-4是從上皮細胞上發現的,最近被鑒定為麻疹病 毒 屬 的 受 體[21-22].CDV入 侵 時,首 先 通 過SLAM和PVRL-4受體在淋巴和上皮組織復制,再侵入神經系統繁殖,形成持續性感染。有研究發現CDV在不能識別PVRL-4受體時,仍能在星形膠質細胞間傳播,大量報道已證明另一受體SLAM不在星形膠質細胞上表達,由此推測膠質細胞存在至今未被發現的第3個CDV細胞受體[23].

          有趣的是,CDV不需要H基因作相應突變即能使用人類和犬的PVRL-4作為受體,有完整C蛋白的CDV有可能使用人PVRL-4作為受體在人上皮細胞內復制[24].CDV也能通過H基因上一個簡單的突變來使 用人類SLAM作 為受體[25].由于CDV可以通過變異而實現種間傳播,CDV有可能成為一種潛在的人類病原體。

          4.1信號淋巴細胞激活因子

          信號淋巴細胞激活因子(SLAM)也稱CD150,是包含有胞質末端和特征信號序列的一類雙功能受體,屬于免疫球蛋白CD2超家族成員之一。SLAM蛋白分子質量為70ku,由細胞外的V和C2結構域及跨膜區和胞內區組成,具有調控機體淋巴細胞增殖、合成免疫球蛋白和分泌共刺激因子等重要作用。通過不同食肉動物的SLAM核苷酸序列比較和構建SLAM的三維模型,推測有34個氨基酸在食肉動物的SLAM與CDV相互作用結合域中起重要作用[26].

          SLAM的發現為研究CDV感染機制和病理現象提供了有力的理論基礎。黃娟等[27]采用間接免疫熒光法發現水貂SLAM在肝、脾、肺、腎、腦組織中均有分布,CDV感染會引起水貂SLAM受體表達的上調。為研究水貂SLAM受體與CDV結構蛋白的相互作用,王聰等[28]成功獲得分子質量約為63.2ku的SLAM-GST融合蛋白。

          Vero和MDCK細胞作為體外分離CDV的常用細胞系,均不表達CDV的重要受體犬的SLAM,為CDV的分離和生物學特性研究提供一種有效細胞系。朱穎等[29]建立了穩定表達犬SLAM的BHK-21細胞系。不同物種的SLAM氨基酸序列之間有差異,處于61位點的組氨酸及鄰近的60位點和63位點氨基酸殘基對CDV病毒吸附起關鍵作用,而PVRL-4在哺乳動物中 較 保 守[26],當SLAM相 比PVRL-4對 決 定CDV宿主特異性作用更大。

          4.2黏連蛋白4(PVRL-4/nectin-4)

          2011年PVRL-4被鑒定為MV和CDV的上皮細胞受體[21-22].PVRL-4是黏附分子中黏連蛋白族群的一員。黏附分子屬含有黏連蛋白-1、-2、-3、-4和原型脊髓灰質炎病毒受體(PVR)的免疫球蛋白超家族。黏連蛋白主要有黏附作用,是細胞間黏附體系的組成部分,并在限制細胞活動、促進細胞間聯系、調節擴散方面起重要作用。

          PVRL-4是Ⅰ型跨膜糖蛋白并有3個類免疫球蛋白的胞外域(V域,2個C2域)、1個跨膜區、1個胞質區。V域與黏連蛋白間同型和異型交互作用有關,而C2域提高了這些交互作用的親和力。PVRL-4在多種癌細胞表面表達,并被認為是肺癌、卵巢癌和轉移性乳腺癌的腫瘤細胞標志物。

          MV吸附PVRL-4從而靶向腫瘤細胞使MV作為融瘤細胞替代物具備可能性[30].有研究證明RNAi試驗和PVRL-4抗體抑制犬PVRL-4表達能降低CDV滴度和增強型綠色熒光蛋白 (en-hanced green fluorescent protein,EGFP)的熒光反應,犬PVRL-4能促進合胞體形成,試驗用siRNA處理受體會抑制合胞體形成[25].2014年有試驗證明犬PVRL-4的V域對CDV侵入、細胞間傳播、合胞體形成至關重要。此外犬PVRL-4V域中的4個氨基酸(F132、P133、A134、G135)和CDV H蛋白的2個氨基酸(P493、Y539)對受體介導病毒侵入十分重要[24].

          5結語

          CDV H蛋白的抗原表位容易發生漂移,引起毒株的抗原性變異,是CDV感染野生動物,甚至感染新宿主或形成新基因型的重要原因。但CDV生物學特性變化原因不僅局限于H蛋白變異。其他結構蛋白如F、P蛋白變化也會使CDV發生變異,因此對各個結構蛋白進行全面分析有助于準確解釋CDV宿主范圍擴大和形成變異株的原因。基因重組是影響RNA病毒基因多樣性的重要因素,在研究CDV基因變異時,不能忽略基因的重組現象。確定CDV變異現象是自身基因變化還是不同基因型發生重組所致具有重要意義。近年犬瘟熱疾病暴發頻繁,特別在野生保護動物和已免疫動物上,因此加強對犬瘟熱病毒流行毒株的監測十分重要。

          PVRL-4受體的發現對深入研究CDV與細胞受體的相互作用、CDV的感染機制及病毒種間傳播原因提供了重要幫助。對CDV受體分布研究有助于明確病毒的宿主范圍和組織嗜性。研究CDV與其受體的相互作用機制是闡述病毒的吸附機制以及在體內的擴散方式的重要途徑,并為開發治療犬瘟的新型藥物和新型疫苗提供新的思路。隨著人們生活水平提高,寵物與人類關系日益密切,而人類與CDV的另一宿主靈長類獼猴親緣關系相近,CDV新毒株將具有感染人類的潛在可能性,因此對新毒株流行監控及其受體深入研究十分重要。

          參考文獻:

          [1] 張淼,劉清彪,劉宗架,等。犬瘟熱病原學研究進展 [J].中國畜牧獸醫,2009,36(11):162-166.

          [2]Curran M D,Clarke D K,Rima B K.The nucleotide sequenceof the gene encoding the attachment protein H of canine dis-temper virus[J].J Gen Virol,1991,72(2):443-447.

          [3]Iwatsuki K,Miyashita N,Yoshida E,et al.Molecular andphylogenetic analyses of the haemagglutinin(H)proteins offield isolates of canine distemper virus from naturally infecteddogs[J].J Gen Virol,1997,78(1):3733-3780.

         

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